Xác định thành phần loài sán lá gan nhỏ ký sinh trên người tại 10 tỉnh ở Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử hệ gen ty thể

Theo thông báo của tổ chức y tế thế giới, có trên  23 triệu người nhiễm sán lá gan nhỏ  và phân bố ở  nhiều nước, đặc biệt ở các nước nhiệt đới [3, 5 việc chẩn đoán, giám định và phân loại nhiều loại sinh vật, trong đó có sán lá gan nhỏ cho đến nay  vẫn dựa vào hình  thái học (kiểu hình) là chính. phương pháp sinh học phân tử đang được ứng dụng ngày càng rộng rãi và có hiệu quả trong mọi lĩnh vực sinh học trong đó có giun sán [1, 2].tại việt nam, sán lá  gan nhỏ (clonorchis và opisthorchis) lưu hành ở ít nhất 19 tỉnh với tỷ lệ nhiễm có nơi 37% (nam định, phú yên) [3, 8]. vấn đề định loại bằng hình thái học đã đóng góp to lớn vào việc xác định thành phần loài sán lá gan nhỏ, song vẫn còn những hạn chế nhất định và chính phân loại bằng sinh học phân tử sẽ khắc phục được những khiếm khuyết đó. do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với mục tiêu:sử dụng kỹ thuật pcr để xác định thành phần loài sán lá gan nhỏ ở việt nam.

i. đối   tượng   và   phương    pháp nghiên cứu

1. thu thập mẫu

mẫu sán lá gan nhỏ được thu thập từ bệnh nhân bằng đãi phân khi điều trị đặc hiệu hoặc phẫu thuật gan mật.số lượng mẫu: sán lá gan nhỏ được thu thập từ ninh bình, thanh hoá, nam định, bắc giang, hoà bình, hà tây, hà nam, quảng ninh, nghệ an và đồng nai.

2. bảo quản mẫu

mẫu sán được rửa sạch bằng nước muối sinh lý và được cố định trong cồn 70% và bảo quản lạnh– 200c cho đến khi sử dụng.

3. phương pháp và kỹ thuật pcr

tách chiết adn:

adn tổng số được tách chiết bằng bộ hoá chất genomic-tip kit hoặc adneasy (qiagen inc.) theo qui trình của nhà sản xuất. mô tả rút gọn như sau: mẫu vật bảo quản trong cồn 70% được lấy ra và cho cồn bay hơi hết trong ly tâm chân không, sau đó rửa nhiều lần trong pbs. mẫu vật được nghiền kỹ và xử lý với các dung môi của kit, rồi hấp phụ lên màng và ly chiết adn theo qui trình tách chiết. hàm lượng  adn sử dụng là khoảng

100 – 150 nanogram cho mỗi phản ứng pcr có dung lượng 50 microlit.

chọn mồi cho phản ứng pcr:

gen cox1 (cytochrome oxidase 1) là gen ty thể được chọn làm đích nghiên cứu. cặp mồi (primer) dùng trong nhân bản adn đích bằng phản ứng pcr (polymerase chain reaction), được chọn trên cơ sở các trình tự  bảo tồn của gen này có trong ngân hàng gen hoặc trên các tài liệu đã xuất bản. quy trình phản ứng pcr:
adn đích lã được nhân bản bằng pcr tiêu chuẩn với bộ hoá chất pcr master mix kit (promega).  chu  trình  nhiệt  của  pcr  trên  máy perkin-elmer (perkin-elmer inc., mỹ) gồm các bước như sau: 940c / 5 phút trong 1 chu kỳ; tiếp theo là 35 chu kỳ ở 940c / 1 phút, 500c /1 phút và 720c /1 phút; chu kỳ  cuối  kéo dài 10 phút ở  720c. sản phẩm pcr được tinh chế bằng bộ hoá chất qiaquick pcr purification kit (qiagen inc.) và được dòng hoá vào vector có tên gọi là pcr 2.1 hoặc pcr 2.1 (topo) của bộ hoá chất ta-cloning kit (invitrogen inc.). vector pcr 2.1 tiếp nhận sản phẩm pcr được chuyển nạp vào dòng tế bào ivn f và chọn lọc khuẩn lạc theo phương pháp kháng sinh và  chỉ thị màu  (sambrook và russell, 2001). adn của plasmid có chứa pcr được tách chiết với bộ  hoá  chất  qiaprep spin plasmid extraction kit (qiagen inc.).

4. phương pháp xử lý  nucleotid / chuỗi  acid amin và ứng dụng sinh – tin học xử lý kết quả

trình  tự  nucleotid  của  adn  trong  plasmid chứa sản phẩm pcr tái tổ hợp được giải trình trên máy tự động abi 377 (abi 377 automated se- quencer)  của hãng perkin – elmer (mỹ). chuỗi nucleotid được xử lý bằng chương trình seqed1.3; sau đó so sánh sử dụng chương trình asembly- lign 1.9 và macvector 6.5.3 (oxford molecular inc.). thành phần acid amin được thu nhận bằng cách sử dụng bộ mã của hệ gen ty thể của sán dẹt trong ngân hàng gen thông qua chương trình gendoc 2.5. trong phân tích phả hệ, tất cả các chuỗi của các chủng chọn lọc trong đó có các chủng của việt nam được sắp xếp theo chương trình gendoc 2.5, sau đó được đưa vào  phân tích  phả hệ  bằng chương  trình  mega  2.1  về thành phần nucleotid và acid amin, sử dụng hệ số tiến hoá thấp me (minimum evolution index) (kuma và cộng sự, 2001).

5. các chuỗi đã biết được dùng để so  sánh trong nghiên cứu

clonorchis sinensis quảng tây (trung quốc)= cscn;  nam hàn (hàn quốc)= cskor;  thanh hoá  (việt  nam) = csngth1; ninh bình (việt nam) = csngnb1; fasciola gigantica bình định (việt nam) = fgngbd; geelong (australia) = fhaus.

ii. kết quả

các mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành thu thập từ  người tại ninh bình, thanh hoá,  nam định, bắc giang, hoà bình, hà tây, hà nam, quảng ninh, nghệ an và đồng nai được xác định sơ bộ bằng hình thái học và được thẩm định bằng sinh học phân tử  (kỹ thuật pcr) sử dụng chuỗi gen cox1 hệ gen ty thể.
hình 1. clonorchis sinensis thu thập từ người bệnh ở việt nam các giải trình tự nucleotid và acid amin được so sánh với các chuỗi mẫu đã biết trước như với các chuỗi cox1 của trung quốc, hàn quốc và các đoạn gen cox1 của các mẫu sán lá gan nhỏ ở thanh hoá, ninh bình đã được xác định trước đây.