Xác định tính đa hình của các gen TP53 và gen MDM2 ở bệnh nhân ung thư phổi

by

Xác định tính đa hình của các gen TP53 và gen MDM2 ở bệnh nhân ung thư phổi

Xác định tính đa hình của các gen TP53 và gen MDM2 ở bệnh nhân ung thư phổi.Ung thư phổi là loại ung thư thường gặp nhất và có tỷ lệ tử vong cao nhất trong các loại hình ung thư hiện nay. Theo số liệu thống kê cập nhật tình hình ung thư trên toàn thế giới Globocan 2012, ung thư phổi có tỷ lệ mới mắc và tử vong hàng đầu ở nam giới, tỷ lệ mới mắc đứng thứ 3 và tỷ lệ tử vong đứng thứ 2 ở nữ giới. Cũng theo thống kê này, Việt nam là quốc gia nằm trong nhóm những nước có tỷ lệ mới mắc ung thư phổi cao nhất ở nam giới và đứng thứ 4 ở nữ giới [1]. Cho đến nay, phẫu thuật vẫn được xem là phương pháp điều trị hiệu quảnhất đối với ung thư phổi. Tuy nhiên, khoảng 50% bệnh nhân ung thư phổi khi được phát hiện đã ở giai đoạn muộn, không còn khả năng phẫu thuật, khi đó các phương pháp hóa trị, xạ trị được chỉ định nhưng hiệu quả hạn chế và thường mang lại nhiều tác dụng không mong muốn, làm giảm chất lượng cuộc sống của bệnh nhân [2]. Chính vì vậy việc phát hiện sớm các yếu tố nguy cơ để có biện pháp theo dõi và chẩn đoán sớm, can thiệp kịp thời sẽ đóng vai trò đặc biệt quan trọng nhằm ngăn ngừa sự phát sinh, phát triển ung thư đồng thời nâng cao hiệu quả của công tác khám và điều trị bệnh.

Nghiên cứu cơ chế phân tử trong ung thư đã chứng minh rằng sự tích lũyđột biến gen theo thời gian dẫn tới sự phát sinh, phát triển mọi dạng tế bào ung thư trong cơ thể. Quá trình chuyển dạng tế bào sang ác tính thường được đánh dấu bằng sự kích hoạt các gen gây ung thư và đột biến gây bất hoạt các gen áp chế ung thư dẫn đến tế bào không ngừng tăng sinh, biệt hóa và kháng lại sự chết
tế bào (apoptosis) [3]. Cơ chế điều hoà gen đóng vai trò quan trọng và sự rối loạn cơ chế điều hoà này khiến hệ thống các enzym sửa chữa gen của tế bàokhông thể khắc phục dẫn tới việc tích lũy một số lượng lớn các đột biến, khởi phát quá trình ung thư. Sự điều hoà gen thông qua mức độ biểu hiện gen, sựtương tác gen và hoạt động của các gen đó trong các con đường tín hiệu tế bào.
Điều này có liên quan chặt chẽ đến kiểu gen thể hiện bằng các đa hình nucleotid2đơn (single nucleotide polymorphisms – SNPs) nằm rải rác trên toàn bộ chiều dài của gen. Chính sự khác biệt một vài nucleotid trong các SNPs của gen có thể làm thay đổi cấu trúc phân tử protein và từ đó làm thay đổi sự tương tác và hoạt động của protein được mã hoá bởi gen đó.
Các gen TP53 và MDM2 là nhóm gen nằm trong con đường tín hiệu p53- con đường đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì tính ổn định của bộ gen dưới tác động của các yếu tố có hại như sự thương tổn DNA, giảm oxy máu, rối loạn chuyển hóa hay tăng cường hoạt động của các gen sinh ung thư. Với mỗi biến đổi xảy ra trên gen TP53 hay gen MDM2 đều có thể làm thay đổi quá trình sinh lý tế bào và dẫn đến nguy cơ phát sinh, phát triển ung thư [4], [5], [6], [7].
Bên cạnh đó, gen TP53 và gen MDM2 đều là những gen đa hình, nhiều đa hình nucleotid đơn của 2 gen này đã được tìm thấy tạo ra những kiểu gen (genotype) khác nhau trong cộng đồng [8], [9], [10], [11]. Tuy nhiên, không phải tất cả các kiểu gen đó đều có khả năng thúc đẩy sự hình thành và tiến triển ung thư. Trên thực tế, người ta đã xác định được một số SNPs của gen TP53 và gen MDM2 có vai trò quan trọng trong bệnh sinh một số loại ung thư, trong đó có ung thư phổi [12]. Việc xác định các SNPs này có vai trò quan trọng trong việc đánh giá nguy cơ mắc bệnh và khả năng đáp ứng điều trị đối với từng cá thể.
Tại Việt Nam, trong những năm gần đây đã có một số công trình nghiên cứu về vai trò của gen TP53 trong ung thư phổi, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào đánh giá tính đa hình của gen TP53 cũng như vai trò của gen MDM2 thông qua các SNPs liên quan đến ung thư phổi. Nghiên cứu: “Xác định tính đa hình của các gen TP53 và gen MDM2 ở bệnh nhân ung thư phổi ” được thực hiện với 2 mục tiêu chính:
1. Xác định tỷ lệ kiểu gen của một số đa hình gen TP53 và gen MDM2 ở bệnh nhân ung thư phổi và người bình thường.
2. Phân tích mối liên quan giữa một số đa hình gen TP53 và gen MDM2 với nguy cơ ung thư phổi

CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Xác định tính đa hình của các gen TP53 và gen MDM2 ở bệnh nhân ung thư phổi
1. Trần Khánh Chi, Trần Vân Khánh, Nguyễn Đức Hinh, Nguyễn Thị Hà, Lê Văn Hưng, Tạ Thành Văn, Trần Huy Thịnh (2014). Xác định tính đa hình đơn Pro47Ser p53 trên bệnh nhân ung thư phổi bằng kỹ thuật giải trình tự gen. Tạp chí nghiên cứu y học. Tập 91, số 5, trang 1-5.
2. Trần Khánh Chi, Trần Vân Khánh, Nguyễn Đức Hinh, Nguyễn Thị Hà, Trần Thị Oanh, Tạ Thành Văn, Trần Huy Thịnh (2014). Xác định tính đa hình đơn tại vị trí
309 của gen MDM2 ở bệnh nhân ung thư phổi bằng phương pháp PCR-RFLP. Tạp chí nghiên cứu y học . Tập. 90, số 5, trang 35-42.
3. Trần Khánh Chi, Trần Huy Thịnh, Nguyễn Thị Hà và Trần Vân Khánh (2015). Đa hình đơn Nucleotid 309 gen MDM2 và nguy cơ ung thư phổi. Tạp chí Y học Việt Nam. Tập 433, số đặc biệt, trang 50-54
4. Trần Khánh Chi, Trần Huy Thịnh (2017). Xác định tính đa hình thêm 16 base pairs ở vùng intron 3 gen TP53 trên bệnh nhân ung thư phổi bằng phương pháp PCR. Tạp chí nghiên cứu y học. Tập 107, số 2 , trang 1-6.
5. Trần Khánh Chi, Trần Huy Thịnh (2017). Mối liên quan giữa SNP72 gen p53 và SNP 309 gen MDM2 với nguy cơ ung thư phổi. Tạp chí nghiên cứu y học. Tập 106, số 1, trang 1-8.
6. Trần Khánh Chi, Lê Hoàn, Trần Huy Thịnh (2017). Xác định một số đa hình gen TP53 trong ung thư phổi. Tạp chí Y học Việt Nam. Số đặc biệt, trang 176-182

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………………………….. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ……………………………………………………………… 3
1.1. Ung thư phổi…………………………………………………………………………………………..3
1.1.1. Dịch tễ học ung thư phổi……………………………………………………………………..3
1.1.2. Bệnh nguyên, bệnh sinh ung thư phổi…………………………………………………..5
1.1.3. Chẩn đoán ung thư phổi…………………………………………………………………….18
1.1.4. Điều trị ung thư phổi…………………………………………………………………………19
1.2. Tổng quan về SNP………………………………………………………………………………..20
1.2.1. Định nghĩa SNP ……………………………………………………………………………….20
1.2.2. Các loại SNPs…………………………………………………………………………………..22
1.2.3. Vai trò và ứng dụng của SNPs trong Y học…………………………………………22
1.2.4. SNPs và ung thư phổi ……………………………………………………………………….23
1.3. Gen TP53 và gen MDM2………………………………………………………………………25
1.3.1.Gen TP53 …………………………………………………………………………………………25
1.3.2. Gen MDM2……………………………………………………………………………………..31
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …….. 39
2.1. Đối tượng nghiên cứu……………………………………………………………………………39
2.1.1. Nhóm bệnh………………………………………………………………………………………39
2.1.2. Nhóm chứng…………………………………………………………………………………….39
2.2. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………………………………..39
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu…………………………………………………………………………..39
2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu…………………………………………………………………………..40
2.2.3. Các chỉ số nghiên cứu……………………………………………………………………….40
2.2.4. Trang thiết bị, hóa chất………………………………………………………………………41
2.2.5. Quy trình nghiên cứu ………………………………………………………………………..42
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu…………………………………………………………48
2.3.1. Địa điểm nghiên cứu…………………………………………………………………………482.3.2. Thời gian nghiên cứu………………………………………………………………………..48
2.4. Xử lý số liệu ………………………………………………………………………………………….48
2.5. Đạo đức trong nghiên cứu của đề tài…………………………………………………….48
2.6. Kinh phí thực hiện đề tài………………………………………………………………………49
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………………………………………….. 51
3.1. Đặc điểm của nhóm đối tượng nghiên cứu……………………………………………51
3.1.1. Đặc điểm về tuổi của nhóm nghiên cứu………………………………………………51
3.1.2. Đặc điểm về giới của nhóm nghiên cứu………………………………………………52
3.1.3. Tình trạng hút thuốc lá của nhóm nghiên cứu………………………………………53
3.1.4. Đặc điểm mô bệnh học của nhóm ung thư phổi…………………………………..53
3.2. Kết quả phân tích đa hình kiểu gen TP53……………………………………………..54
3.2.1. Đa hình thêm 16bp tại vùng intron 3 gen TP53……………………………………54
3.2.2. Đa hình kiểu gen tại SNP R72P gen TP53 ………………………………………….55
3.2.3. Xác định một số SNP không có vị trí cắt enzym giới hạn……………………..62
3.3. Kết quả phân tích đa hình kiểu gen SNP 309T>G gen MDM2 ……………..68
3.3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại đoạn gen mang SNP 309T>G của
gen MDM2 ……………………………………………………………………………………………….68
3.3.2. Kết quả xác định kiểu gen tại SNP 309T>G gen MDM2 bằng phương
pháp PCR-RFLP……………………………………………………………………………………….68
3.3.3. Kết quả kiểm tra kiểu gen tại vị trí SNP 309T>G gen MDM2 bằng phương
pháp giải trình tự gen………………………………………………………………………………….69
3.3.4. Kết quả phân tích kiểu gen SNP 309T>G gen MDM2 ở nhóm
nghiên cứu………………………………………………………………………………………………71
3.3.5. Các kiểu gen SNP 309T>G của gen MDM2 và nguy cơ mắc ung thư phổi..73
3.4. Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen TP53 và gen MDM2 với nguy cơ mắc
ung thư phổi ……………………………………………………………………………………………….74
3.4.1. Mối liên quan giữa đa hình gen TP53 và nguy cơ mắc ung thư phổi theo
một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng trong ung thư phổi………………………….743.4.2. Mối liên quan giữa đa hình gen MDM2 SNP 309T>G và nguy cơ mắc ung
thư phổi theo một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng trong ung thư phổi……..76
3.4.3. Nguy cơ mắc ung thư phổi khi kết hợp đa hình gen TP53 SNP R72P và
gen MDM2 SNP 309T>G ………………………………………………………………………….79
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN……………………………………………………………….. 82
4.1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu …………………………………………………82
4.1.1. Đặc điểm về tuổi mắc bệnh của nhóm bệnh nhân ung thư phổi…………….82
4.1.2. Đặc điểm về giới của nhóm nghiên cứu………………………………………………83
4.1.3. Tiền sử hút thuốc lá…………………………………………………………………………..85
4.1.4. Kết quả mô bệnh học của nhóm bệnh nhân ung thư phổi……………………..87
4.2. Đa hình gen TP53 ở nhóm nghiên cứu………………………………………………….89
4.2.1. Đa hình gen thêm 16bp tại vùng intron 3 của gen TP53……………………….90
4.2.2. SNP R72P của gen TP53…………………………………………………………………..91
4.2.3. Một số SNP không có vị trí cắt enzym giới hạn của gen TP53 ……………..94
4.3. Đa hình gen MDM2 ở nhóm nghiên cứu……………………………………………….98
4.4. Mối liên quan giữa đa hình gen TP53 và gen MDM2 với nguy cơ mắc ung
thư phổi…………………………………………………………………………………………………….103
4.4.1. Mối liên quan giữa đa hình gen TP53 và nguy cơ mắc ung thư phổi theo
một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng trong ung thư phổi………………………..104
4.4.2. Mối liên quan giữa đa hình gen MDM2 SNP 309T>G và nguy cơ mắc ung
thư phổi theo một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng trong ung thư phổi…….. 108
4.4.3. Kết hợp đa hình kiểu gen SNP R72P và SNP309 MDM2 với nguy cơ ung
thư phổi…………………………………………………………………………………………………..112
KẾT LUẬN………………………………………………………………………………….. 114
KIẾN NGHỊ…………………………………………………………………………………. 116
CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤCDANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Trình tự mồi cho phản ứng PCR khuếch đại các SNP………………. 47
Bảng 3.1: Đặc điểm về tuổi của nhóm nghiên cứu…………………………………. 51
Bảng 3.2: Tình trạng hút thuốc lá của nhóm nghiên cứu…………………………. 53
Bảng 3.3: Đặc điểm mô bệnh học của nhóm ung thư phổi………………………. 53
Bảng 3.4: Kết quả phân tích đa hình do thêm 16bp tại vùng intron 3 của gen
TP53 ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi và nhóm chứng …………. 55
Bảng 3.5: Tỷ lệ các kiểu gen SNP R72P của gen TP53 ở nhóm nghiên cứu. 59
Bảng 3.6: Tỷ lệ phân bố các kiểu gen của SNP TP53-R72P giữa nhóm bệnh
và chứng ……………………………………………………………………….. 59
Bảng 3.7: Các kiểu gen SNP R72P của gen TP53 và nguy cơ mắc ung thư
phổi………………………………………………………………………………. 61
Bảng 3.8: Độ tuổi trung bình của bệnh nhân ung thư phổi mang các kiểu gen
TP53 SNP R72P…………………………………………………………….. 62
Bảng 3.9: Tỷ lệ kiểu gen của một số SNP không có vị trí cắt enzym giới hạn P34P
(CCC → CCA), P36P (CCG → CCT), P47S (CCG → CTG)……….64
Bảng 3.10: Tần số các kiểu gen tại codon 360 gen TP53………………………… 66
Bảng 3.11: Tỷ lệ các kiểu gen tại codon 217 gen TP53 ………………………….. 67
Bảng 3.12: Tỷ lệ các kiểu gen SNP 309T>G của gen MDM2 ở nhóm nghiên cứu…71
Bảng 3.13: Tỷ lệ phân bố các kiểu gen của SNP MDM2-309T>G giữa nhóm
bệnh và chứng………………………………………………………………… 71
Bảng 3.14: Độ tuổi trung bình của bệnh nhân ung thư phổi mang kiểu các
kiểu gen của SNP MDM2-309T>G ……………………………………. 72
Bảng 3.15: Các kiểu gen SNP 309T>G của gen MDM2 và nguy cơ mắc ung
thư phổi…………………………………………………………………………. 73Bảng 3.16: Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen TP53 SNP R72P và nguy cơ
mắc ung thư phổi theo giới……………………………………………….. 74
Bảng 3.17: Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen TP53 SNP R72P và nguy cơ
mắc ung thư phổi theo mô bệnh học…………………………………… 75
Bảng 3.18: Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen TP53 SNP R72P và nguy cơ
mắc ung thư phổi theo trình trạng hút thuốc lá …………………….. 76
Bảng 3.19: Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MDM2 SNP 309T>G và
nguy cơ mắc ung thư phổi theo giới …………………………………… 76
Bảng 3.20: Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MDM2 SNP309T>G và
nguy cơ mắc ung thư phổi theo mô bệnh học ………………………. 77
Bảng 3.21: Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MDM2 SNP 309T>G và
nguy cơ mắc ung thư phổi theo tình trạng hút thuốc lá………….. 78
Bảng 3.22: Nguy cơ mắc ung thư phổi khi kết hợp đa hình gen TP53 SNP
R72P và gen MDM2 SNP 309T>G với hút thuốc lá……………… 79
Bảng 3.23: Kết hợp đa hình kiểu gen TP53 SNP R72P và SNP 309T>G
MDM2 với nguy cơ ung thư phổi ………………………………………. 80
Bảng 4.1: Tỷ lệ các kiểu gen SNP 309T>G MDM2 trên bệnh nhân ung thư
phổi và nhóm chứng trong một số nghiên cứu trên thế giới….. 100
Bảng 4.2: Kết quả phân tích kiểu gen SNP 309T>G gen MDM2 và nguy cơ
mắc ung thư phổi theo chủng tộc trong nghiên cứu của Gui…. 102DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Tỷ lệ mới mắc ung thư phổi ở nam giới chuẩn hóa theo tuổi ………. 3
Hình 1.2: Tỷ lệ mới mắc ung thư phổi ở nữ giới chuẩn hóa theo tuổi …………. 4
Hình 1.3: Các con đường tín hiệu phân tử trong bệnh sinh ung thư phổi …….. 9
Hình 1.4: Con đường tín hiệu phát triển ung thư phổi thông qua RTKs…….. 10
Hình 1.5: Các con đường gây apoptosis của gen TP53 …………………………… 11
Hình 1.6: Các con đường hoạt hóa thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô……… 12
Hình 1.7: Dung hợp gen EML4-ALK do đảo đoạn trên NST 2…………………. 14
Hình 1.8: Cấu tạo của ALK-TK và con đường hoạt hóa thụ thể ALK-TK…. 14
Hình 1.9: Hiện tượng đa hình nucleotid đơn…………………………………………. 22
Hình 1.10: Cấu trúc phân tử protein p53………………………………………………. 26
Hình 1.11: Cơ chế kiểm soát chu kỳ tế bào của p53 qua trung gian p21 ……. 28
Hình 1.12: Các SNPs trên các vùng mã hóa và không mã hóa của gen TP53 29
Hình 1.13: Cấu trúc phân tử protein MDM2…………………………………………. 31
Hình 1.14: Vai trò điều hòa p53 của MDM2 ………………………………………… 32
Hình 1.15: Đa hình SNP 309 T/G……………………………………………………….. 34
Hình 2.1. Mô tả hình ảnh điện di xác định đa hình gen do thêm 16bp tại vùng
intron 3 của gen TP53………………………………………………………. 43
Hình 2.2: Xác định kiểu gen R72P bằng kỹ thuật PCR-RFLP …………………. 45
Hình 2.3: Xác định kiểu gen SNP309 gen MDM2 bằng kỹ thuật PCR-RFLP46
Hình 3.1: Tỷ lệ bệnh nhân ung thư phổi theo nhóm tuổi…………………………. 52
Hình 3.2: Đặc điểm về giới của nhóm nghiên cứu…………………………………. 52
Hình 3.3: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen vùng intron 3
gen TP53 trên gel agarose 3%……………………………………………. 54
Hình 3.4: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen chứa SNP
R72P gen TP53 trên gel agarose 1,5%. ……………………………….. 56Hình 3.5: Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen TP53 mang SNP R72P
bằng enzym BstUI trên các mẫu nghiên cứu. ……………………….. 57
Hình 3.6: Kết quả giải trình tự exon 4 gen TP53 chứa SNP R72P tương ứng với các
kiểu gen GC (R72P R/P), CC (R72P P/P), GG (R72P R/R). …………..58
Hình 3.7: Phân bố các kiểu gen của SNP TP53-R72P giữa nhóm bệnh và
chứng…………………………………………………………………………….. 60
Hình 3.8: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon 4 gen TP53 mang SNP:
P34P, P36P, P47S……………………………………………………………. 62
Hình 3.9: Hình ảnh kết quả giải trình tự exon 4 gen TP53 mang SNP: P34P,
P36P, P47S tương ứng với các kiểu gen C/C, G/G, C/C. ……….. 63
Hình 3.10: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon 10 gen TP53 chứa SNP
G360A trên gel agarose 1,5% ……………………………………………. 64
Hình 3.11: Kết quả giải trình tự exon 10 xác định kiểu gen tại SNP G360A
gen TP53 ……………………………………………………………………….. 65
Hình 3.12: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon 6 gen TP53 chứa SNP
V217M trên gel agarose 2%………………………………………………. 66
Hình 3.13: Kết quả giải trình tự exon 6 xác định kiểu gen tại SNP V217M gen
TP53 ……………………………………………………………………………… 67
Hình 3.14: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen mang SNP 309T>G của
gen MDM2……………………………………………………………………… 68
Hình 3.15: Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen MDM2 mang SNP
309T>G bằng enzym MspA1i trên các mẫu nghiên cứu…………. 69
Hình 3.16: Kết quả giải trình tự đoạn gen chứa SNP 309T>G gen MDM2
tương ứng kiểu gen T/T, T/G, G/G …………………………………….. 70
Hình 3.17: Phân bố các kiểu gen của SNP MDM2-309T>G giữa nhóm bệnh
và chứng ………………………………………………………………………… 7a

Leave a Comment