Xác định tính đặc hiệu enzym giới hạn bằng phân tích đầu tận cùng của các đoạn ADN bị cắt

Trong y học việc chẩn đoán và nghiên cứu bệnh lý ở mức độ ADN ngày càng quan trọng.

Để phân tích được các ADN genom cần dùng đến phản ứng cắt ADN giới hạn để tạo thành các mảnh nhỏ có kích th−ớc nhất định. Phản ứng này đ−ợc xúc tác bắng các enzym giới hạn thuỷ phân ADN ở các vị trí quyết định sau khi đã nhận trình tự đặc hiệu gồm từ 4 đến 8 bp. Tập hợp các enzym giới hạn là hết sức đa dạng và có nguồn gốc phong phú là các vi khuẩn không phân biệt loại chi. Hiện nay, trên thế giới đã thu thập hơn 200 enzym giới hạn có tính đặc hiệu khác nhau. Nếu tính đủ các loại trình tự từ 4 đến 8 nucleotid có tính liên tục hay không, số enzym giới hạn phải hơn 1000 [1]. Với mục đích có đ−ợc enzym để có thể cắt ADN ở bất cứ vị trí mong muốn nào, chúng tôi tiếp tục khảo sát các enzym giới hạn có tính đặc hiệu mới [2].

Đến nay, các enzym giới hạn đ−ợc xác định chủ yếu bằng các trình tự nucleotid đ−ợc nhận ra trên ADN. Nh−ng các enzym giới hạn nhận ra cùng một trình tự có thể cắt ADN ở các vị trí khác nhau nằm trong vị trí nhận đối với các trình tự đối xứng hoặc ngoài vị trí nhận cách xa và  nucleotid đối  với  các  trình tự  không đối xứng. Hai enzym mới đ−ợc tìm ở Việt Nam, Sml I nhận ra trình tự đối xứng 5-CTPuPyAG- 3 [3] và BciV I nhận ra trình tự không đối xứng  5-GTATCC-3/3-CATAGG  [4]  đ−ợc xác định vị trí cắt.

Mục tiêu công trình này là xác định tính đặc hiệu các enzym giới hạn bằng phân tích vị trí cắt của nó trên ADN.

I. Phương pháp vật liệu nghiên cứu

1. Các sinh phẩm

ADN đích M13 mp18 và ADN mồi ng−ợc có vị trí 944-924 gắn biotin.

ADN đích pUC19 và ADN mồi ng−ợc có vị trí 2627-2608 gắn biotin. Sml I và BciV I là hai enzym giới hạn mới được tìm ở hai chủng vi khuẩn thiên nhiên phân lập tại Việt Nam từ Stenotrophomonas maltophilia và Bacillus circulans. Sml I nhận trình tự 5-CTPyPuAG-3. BciV I nhận trình tự 5-GGATAC-3 /5-GTATCC-3.