Xác định tính đặc hiệu enzym giới hạn bằng phân tích đầu tận cùng của các đoạn adn bị cắt

Các enzym giới hạn cắt ADN kép ở các vị trí đặc hiệu ngoài hoặc trong trình tự nucleotid được nhận ra và để lại 3 dạng các đầu tận cùng: phẳng; chéo có ADN đơn 3’ thừa, chéo có ADN đơn 5’ thừa. Nghiên cứu này dùng một phương pháp cho phép xác định kiểu cắt của các enzym giới hạn. Phương pháp giải trình tự Sanger được sử dụng để phân tích ADN ở xung quanh vị trí cắt nhưng dùng chất không phóng xạ. Song song các đoạn ADN tổng hợp kéo dài được cắt bằng enzym giới hạn. Phản ứng Klenow mang hai hoạt tính là tổng hợp ADN 5’^ 3’ và exonucleasa 3’^ 5’ cho phép xác định kiểu cắt của enzym giới hạn. Kết quả đã cho phép xác định vị trí cắt của hai enzym mới. Điểm cắt Sml I nằm trong trình tự đối xứng được nhận: 5’- Cị TPuPy AtG – 3’. BciV I nhận ra một trình tự không đối xứng và cắt ngoài vị trí nhận : 5’ – GTATCC(N)6 i – 3’/3’- CATAGG(N)5 t – 5’.

Trong y học việc chẩn đoán và nghiên cứu bệnh lý ở mức đô ADN ngày càng quan trọng. Để phân tích được các ADN genom cẩn dùng đến phản ứng cắt ADN giới hạn để tạo thành các mảnh nhò có kích thước nhất định. Phản ứng này được xúc tác bắng các enzym giới hạn thuỷ phân ADN ở các vị trí quyết định sau khi đã nhận trình tự đạc hiệu gồm từ 4 đến 8 bp. Tập hợp các enzym giới hạn là hết sức đa dạng và có nguồn gốc phong phú là các vi khuẩn không phân biệt loại chi. Hiện nay, trên thế giới đã thu thập hơn 200 enzym giới hạn có tính đạc hiệu khác nhau. Nếu tính đủ các loại trình tự từ 4 đến 8 nucleotid có tính liên tục hay không, số’ enzym giới hạn phải hơn 1000 [1]. Với mục đích có được enzym để có thể cắt ADN ở bất cứ vị trí mong muốn nào, chúng tôi tiếp tục khảo sát các enzym giới hạn có tính đạc hiệu mới [2].
Đến nay, các enzym giới hạn được xác định chủ yếu bằng các trình tự nucleotid được nhận ra trên ADN. Nhưng các enzym giới hạn nhận ra cùng môt trình tự có thể cắt ADN ở các vị trí khác nhau nằm trong vị trí nhận đối với các trình tự đối xứng hoặc ngoài vị trí nhận cách xa và nucleotid đối với các trình tự không đối xứng. Hai enzym mới được tìm ở Việt Nam, Smỉ I nhận ra trình tự đối xứng 5’-CTPuPyAG- 3’ [3] và BciV I nhận ra trình tự không đối xứng 5 ’ -GTATCC- 3 ’ /3 ’ -CATAGG [4] được xác định vị trí cắt.
Mục tiêu công trình này là xác định tính đặc hiệu các enzym giới hạn bằng phân tích vị trí cắt của nó trên ADN.