Xác định và định lượng vi khuẩn Porphyromonas Gingivalis trong viêm nha chu bằng kỹ thuật real time PCR

Viêm nha chu (VNC) là một bệnh nhiễm khuẩn phá hủy các mô nâng đỡ răng. Bệnh diễn tiến dai dẳng, kéo dài, có khi để lại những hậu quả nặng nề như răng lung lay hàng loạt phải nhổ bỏ làm mất chức năng ăn nhai, ảnh hưởng đến sức khỏe và thẩm mỹ. Viêm nha chu khá phổ biến, tuy nhiên tỷ lệ và mức độ bệnh thay đổi tùy theo mỗi nơi. Tại Mỹ, tỷ lệ này là 3-7,2% [2]. Ở Việt Nam, tổng kết năm 2000 của Trần Văn Trường cho thấy 36,5% nam và 27,5% nữ có túi nha chu [10].

Vi khuẩn trong viêm nha chu đa dạng. Mặc dù hệ tạp khuẩn vùng miệng có hơn 700 loài vi khuẩn, nhưng chỉ có một số được cho là tác nhân gây viêm nha chu: Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Tannerella forsythensis, Prevotella intermedia là những vi khuẩn thường gặp trong viêm nha chu. Đặc biệt, trực khuẩn kỵ khí P. gingivalis được xem là một trong những vi khuẩn gây bệnh quan trọng nhất trong viêm nha chu [6].

Có nhiều phương pháp phát hiện và định danh vi khuẩn như phương pháp nuôi cấy, phương pháp miễn dịch, lai phân tử [6]. Với sự phát triển của công nghệ sinh học phân tử, phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và gần đây real-time PCR (qPCR) được ứng dụng trong chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh nha chu. Đây là một kỹ thuật nhạy và đặc hiệu, cho phép xác định nhanh và chính xác DNA của vi khuẩn chỉ trong vài giờ dựa vào các chu kỳ nhiệt. qPCR còn giúp định lượng vi khuẩn [7].

Thành phần các vi khuẩn trong VNC mạn tính, VNC tấn công khác nhau [5]. Một số những khác biệt vi khuẩn này có ý nghĩa lâm sàng. Việc xác định và định lượng chính xác các vi khuẩn rất cần thiết trong chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh nha chu, điều trị bằng kháng sinh, đánh giá đáp ứng điều trị và theo dõi diễn tiến bệnh. Sự gia tăng số lượng vi khuẩn có thể là yếu tố chỉ ra tình trạng viêm nha chu đang tiến triển. Từ những vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Xác định và định lượng Porphyromonas gingivalis trong viêm nha chu bằng kỹ thuật qPCR”. Nghiên cứu này ứng dụng kỹ thuật qPCR phát hiện và định lượng vi khuẩn P. gingivalis trong dịch khe nướu và trong mảng bám răng dưới nướu, tại các vị trí lành và vị trí có sang thương trong viêm nha chu mạn tính, viêm nha chu tấn công và trong dịch khe nướu của nhóm người bình thường ở người Việt Nam.

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Đối tượng

Mẫu nghiên cứu

Mẫu 10 bệnh nhân VNC*: trong đó có 5 bệnh nhân VNC mạn tính và 5 bệnh nhân VNC tấn công (*: tương tự như cỡ mẫu của Lyons năm 2000 [4]) tại khoa Nha chu – bệnh viện Răng Hàm Mặt Thành phố Hồ Chí Minh.

Nhóm chứng người bình thường:

– 5 người  khỏe mạnh,  cùng độ  tuổi  với nhóm bệnh nhân VNC mạn tính.

– 5 người  khỏe mạnh,  cùng độ  tuổi  với nhóm bệnh nhân VNC tấn công.

Các tiêu chuẩn chọn mẫu nhóm chứng người  bình  thường  tương  tự  nhóm  nghiên cứu, nhưng không có tiền sử bệnh toàn thân và bệnh nha chu, không hút thuốc. Hiện không bị viêm nướu hay viêm nha chu.

Tiêu chuẩn chọn mẫu:

– Tuổi:18 – 60.

– Còn tối thiểu 20 răng.

– Không có thói quen hút thuốc lá. Không có tiền sử bệnh tim mạch, đái tháo  đường, bệnh nội tiết, bệnh chuyển hóa.

– Không sử dụng thuốc kháng sinh, kháng viêm, thuốc tránh thai trong vòng 2 tuần trước khi tham gia nghiên cứu.

– Được chẩn đoán xác định viêm nha chu dựa trên lâm sàng và X quang toàn cảnh.

– Không điều trị nha chu trong vòng 3 tháng trước khi tham gia nghiên cứu.

– Tự nguyện đồng ý tham gia nghiên cứu.

Tiêu chuẩn loại trừ:

– Đang có áp xe nha chu, viêm hay áp xe răng 8.

– Bệnh  nhân  mắc  bệnh  tâm  thần,  HIV, bệnh toàn thân mạn tính.

– Bệnh  nhân  không  đồng  ý   tham  gia nghiên cứu.

2. Phương pháp

Thiết  kế  nghiên  cứu:  nghiên  cứu  cắt ngang, mô tả và phân tích, có nhóm chứng.

Các bước tiến hành: (1) Hỏi bệnh sử và khám lâm sàng, chụp phim toàn cảnh. (2) Làm bệnh án, đánh giá các chỉ số mảng bám răng (PI),  chỉ  số  nướu  (GI),  độ  sâu  túi  nha  chu (PPD), độ mất bám dính lâm sàng (CAL). (3) Chẩn đoán viêm nha chu, và phân loại VNC: VNC mạn tính, VNC tấn công. (4) Lấy bệnh phẩm dịch khe nướu và mảng bám dưới nướu, ở 3 vị trí (răng cửa trên, răng cửa dưới, răng cối lớn thứ nhất hàm trên). Bệnh phẩm được gửi đến Phòng xét nghiệm của Công ty Nam Khoa Biotek và được xử lý ngay trong ngày.

Tại phòng xét nghiệm sinh học phân tử: tiến hành ly trích DNA và real-time PCR để xác  định  sự  hiện  diện,  tỷ  lệ  và  số  lượngP. gingivalis trong mẫu bệnh phẩm