XÂY DỰNG MÔ HÌNH PHÂN LOẠI VÀ DỰ ĐOÁN CÁC CHẤT ỨC CHẾ BƠM NGƯỢC P-GLYCOPROTEIN, NORA VÀ ỨNG DỤNG TRONG VIỆC SÀNG LỌC CÁC CHALCON CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ BƠM NORA CỦA STAPHYLOCOCCUS AUREUS ĐA ĐỀ KHÁNG THUỐC

XÂY DỰNG MÔ HÌNH PHÂN LOẠI VÀ DỰ ĐOÁN CÁC CHẤT ỨC CHẾ BƠM NGƯỢC P-GLYCOPROTEIN, NORA VÀ ỨNG DỤNG TRONG VIỆC SÀNG LỌC CÁC CHALCON CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ BƠM NORA CỦA STAPHYLOCOCCUS AUREUS ĐA ĐỀ KHÁNG THUỐC.Đề kháng đa thuốc (multidrug resistance – MDR) được nhìn nhận là một trong những vấn đề chính thách thức việc điều trị thành công bệnh ung thư cũng như bệnh nhiễm trùng ở người trong nhiều thập kỷ qua. Các tế bào khối u và các chủng vi khuẩn tự bảo vệ mình khỏi sự tấn công của các thuốc hóa trị bằng nhiều cơ chế khác nhau, trong đó sự đề kháng qua trung gian bơm ngược đóng một vai trò rất quan trọng [121], [122], [141]. Bằng cách bài xuất nhiều loại hợp chất đa dạng về cấu trúc ra khỏi tế bào, các protein màng làm cho sự tích lũy nội bào của thuốc giảm xuống thấp dưới nồng độ có tác dụng và vì vậy giúp cho các tác nhân gây bệnh giảm sự nhạy cảm với thuốc [8], [107].

Trong số các protein thuộc hệ thống bơm ngược của cả tế bào có nhân điển hình và tế bào chưa có nhân điển hình, P-glycoprotein ở động vật có vú và NorA ở vi khuẩn là hai protein được nghiên cứu nhiều nhất, liên quan đến vai trò của chúng trong việc chuyên chở thuốc ra ngoài tế bào [107]. P-glycoprotein của người (P-gp/ABCB1/MDR1) và NorA của Staphylococcus aureus tiếp tục là hai mục tiêu thuốc được chọn của đề tài nghiên cứu này bởi vì tầm quan trọng to lớn của chúng về mặt lâm sàng. Với P-gp, bơm ngược này vừa là proteinkhông mục tiêu (antitarget/nontarget) ảnh hưởng đến dược động học và độc tính(ADMET) của nhiều thuốc khác nhau [2], vừa là protein mục tiêu bởi vì sự biểu lộ quá mức của nó đóng góp cho sự đề kháng của ung thư với hóa trị [186]. Trong khiđó, NorA được biết là đóng vai trò chính trong sự phát triển đề kháng của vi khuẩn với các kháng sinh fluoroquinolon [33]. Mặc dù có cấu trúc khác nhau, các bơmngược của động vật có vú và vi khuẩn lại có sự tương đồng chất nền đủ lớn, với nhiều nghiên cứu đã báo cáo các chất ức chế cả P-gp và NorA như verapamil [120], reserpin [162], piperin [82], capsaicin [79], osthol, curcumin [77], …
Qua nhiều thập kỷ nghiên cứu, ba thế hệ các chất ức chế phân tử nhỏ (small molecule inhibitor – SMI) của P-gp được khám phá và phát triển [136], nhưng vẫn chưa có thuốc nào sẵn có cho mục đích chẹn P-gp trên lâm sàng. Những lý do giải thích hợp lý được đưa ra, bao gồm tính tan kém, tính đặc hiệu kém, tác dụng phụ, độc2 tính và tương tác dược động [19], [160], [176]. Mặt khác, cũng chưa có chất ức chế bơm NorA nào được đưa vào thử nghiệm trên người [67]. Trong số các phương pháp hợp lý được đề nghị để ức chế P-gp, các thành phần từ tự nhiên nhận được nhiều sự quan tâm bởi vì tính an toàn, không gây độc [173]. Cho ví dụ, CBT-1 là một alkaloid thực vật loại bisbenzylisoquinolin được công ty CBA Pharma Inc. phát triển như một chất ức chế P-gp dùng đường uống và các kết quả lâm sàng ban đầu đầy hứa hẹn của chất này khi phối hợp với doxorubicin [126] và paclitaxel [81], [125] đã khuyến khích các nỗ lực nghiên cứu tiếp theo để tìm kiếm các chất ức chế bơm ngược mới, an toàn và hiệu quả. Cùng với alkaloid, khung flavonoid cũng được xem xét cho hoạt tính ức chế P-gp ở khối u của người [11], [52], [136], [173] và NorA ở vi khuẩn S. aureus [67], [215]. Các nghiên cứu trên nhóm cấu trúc này đã thu được các dẫn xuất chalconcó tiềm lực ức chế hai loại bơm ngược [69], [139] và góp phần định hướng cho đề tài thực hiện sàng lọc, thử nghiệm hoạt tính sinh học trên tập dữ liệu gần 100 chalcon nội bộ đã được thiết kế và tổng hợp trước đó với sự đa dạng về các nhóm thế.
Các phương pháp thiết kế thuốc với sự trợ giúp của máy tính (computer-aided drug design – CADD) được xem là một lựa chọn khả thi với chi phí thấp, bao gồm thiết kế dựa vào cấu trúc (structure-based) và dựa vào phối tử (ligand-based), giúp dự đoán và làm sáng tỏ các tương tác phối tử – protein trong giai đoạn sớm của quá trình khám phá thuốc [112], [137]. Trọng tâm của đề tài là xây dựng các mô hình phân loại và dự đoán máy tính giúp giải quyết các vấn đề được nhìn nhận từ các nghiên cứu in silico đã được công bố trước đó (tham khảo Mục 4.1.1 và Mục 4.1.2), bao gồm những nghi vấn về khả năng ngoại suy (do được phát triển từ các tập dữ liệu tương đối nhỏ, không đảm bảo tính đa dạng, đồng nhất) và những hạn chế của các mô hình học máy đơn lẻ được báo cáo trong các nghiên cứu này. Ngoài các điều kiện đánh giá thông kê chặt chẽ, khả năng ứng dụng của các công cụ máy tính thu được còn được kiểm chứng bằng các thử nghiệm in vitro trên chủng vi khuẩn chuẩn biểu lộ quá mức bơm ngược cũng như trên các chủng đề kháng phân lập từ lâm sàng. Đồng thời qua đó, các ứng viên ức chế bơm ngược tiềm năng được khám phá.3
Vì những lý do trên, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu xây dựng mô hình phân loai và d ̣ ự đoán các chất ứ c chế bơm ngươc P ̣ -glycoprotein, NorA và ứng dung trong vi ̣ êc sàng l ̣ ọc các chalcon có khả năng ứ c chế bơm NorA của S. aureus đa đề kháng thuốc. Để đạt được mục tiêu này, cần tiến hành bốn nội dung sau đây:
1. Xây dựng các mô hình máy tính dựa trên phối tử, bao gồm:
• Các mô hình học máy đơn lẻ và kết hợp giúp phân loại tốt chất ức chế, chất không ức chế P-gp; và dự đoán tốt hoạt tính ức chế bơm ngược này (IC50).
• Các bản đồ nhận thức về sự chồng phủ phối tử giữa P-gp và NorA, qua đóxác định các tính chất lý hóa, dấu vân tay cần thiết để ức chế ít nhất một trong hai bơm ngược.
• Mô hình pharmacophore cho các chất ức chế P-gp mạnh trong điều trị ungthư và mô hình pharmacophore cho các chất ức chế NorA nhưng không ức chế P-gp trong điều trị nhiễm trùng.
2. Xây dựng các mô hình máy tính dựa trên cấu trúc (mô hình tương đồng của Pgp) và thực hiện docking phân tử nhằm xác định các tương tác gắn kết, cũng như ái lực gắn kết của phức hợp phối tử-protein.
3. Sàng lọc các chất “hit” là những ứng viên ức chế P-gp, NorA mới và hiệu quả từ hai thư viện nội bộ và Ngân hàng Thuốc bằng các công cụ máy tính thu được.
4. Đánh giá in vitro khả năng ức chế bơm ngược NorA của các chalcon “hit” nội bộ, qua đó làm giảm sự đề kháng với ciprofloxacin khi phối hợp trên chủng S. aureus SA-1199B (biểu lộ quá mức NorA) và một số chủng SA lâm sàn2
tính và tương tác dược động [19], [160], [176]. Mặt khác, cũng chưa có chất ức chế bơm NorA nào được đưa vào thử nghiệm trên người [67]. Trong số các phương pháp hợp lý được đề nghị để ức chế P-gp, các thành phần từ tự nhiên nhận được nhiều sự quan tâm bởi vì tính an toàn, không gây độc [173]. Cho ví dụ, CBT-1 là một alkaloid thực vật loại bisbenzylisoquinolin được công ty CBA Pharma Inc. phát triển như một chất ức chế P-gp dùng đường uống và các kết quả lâm sàng ban đầu đầy hứa hẹn của chất này khi phối hợp với doxorubicin [126] và paclitaxel [81], [125] đã khuyến khích
các nỗ lực nghiên cứu tiếp theo để tìm kiếm các chất ức chế bơm ngược mới, an toàn và hiệu quả. Cùng với alkaloid, khung flavonoid cũng được xem xét cho hoạt tính ức chế P-gp ở khối u của người [11], [52], [136], [173] và NorA ở vi khuẩn S. aureus [67], [215]. Các nghiên cứu trên nhóm cấu trúc này đã thu được các dẫn xuất chalcon có tiềm lực ức chế hai loại bơm ngược [69], [139] và góp phần định hướng cho đề tài thực hiện sàng lọc, thử nghiệm hoạt tính sinh học trên tập dữ liệu gần 100 chalcon nội bộ đã được thiết kế và tổng hợp trước đó với sự đa dạng về các nhóm thế. Các phương pháp thiết kế thuốc với sự trợ giúp của máy tính (computer-aided
drug design – CADD) được xem là một lựa chọn khả thi với chi phí thấp, bao gồm thiết kế dựa vào cấu trúc (structure-based) và dựa vào phối tử (ligand-based), giúp dự đoán và làm sáng tỏ các tương tác phối tử – protein trong giai đoạn sớm của quá trình khám phá thuốc [112], [137]. Trọng tâm của đề tài là xây dựng các mô hình phân loại và dự đoán máy tính giúp giải quyết các vấn đề được nhìn nhận từ các nghiên cứu in silico đã được công bố trước đó (tham khảo Mục 4.1.1 và Mục 4.1.2), bao gồm những nghi vấn về khả năng ngoại suy (do được phát triển từ các tập dữ liệu tương đối nhỏ, không đảm bảo tính đa dạng, đồng nhất) và những hạn chế của các mô hình học máy đơn lẻ được báo cáo trong các nghiên cứu này. Ngoài các điều kiện đánh giá thông kê chặt chẽ, khả năng ứng dụng của các công cụ máy tính thu được còn được kiểm chứng bằng các thử nghiệm in vitro trên chủng vi khuẩn chuẩn biểu lộ quá mức bơm ngược cũng như trên các chủng đề kháng phân lập từ lâm sàng. Đồng thời qua đó, các ứng viên ức chế bơm ngược tiềm năng được khám phá.3
Vì những lý do trên, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu xây dựng mô hình phân loai và d ̣ ự đoán các chất ứ c chế bơm ngươc P ̣ -glycoprotein, NorA và ứng dung trong vi ̣ êc sàng l ̣ ọc các chalcon có khả năng ứ c chế bơm NorA của S. aureus đa đề kháng thuốc. Để đạt được mục tiêu này, cần tiến hành bốn nội dung sau đây:
1. Xây dựng các mô hình máy tính dựa trên phối tử, bao gồm:
• Các mô hình học máy đơn lẻ và kết hợp giúp phân loại tốt chất ức chế, chất không ức chế P-gp; và dự đoán tốt hoạt tính ức chế bơm ngược này (IC50).
• Các bản đồ nhận thức về sự chồng phủ phối tử giữa P-gp và NorA, qua đó xác định các tính chất lý hóa, dấu vân tay cần thiết để ức chế ít nhất một trong hai bơm ngược.
• Mô hình pharmacophore cho các chất ức chế P-gp mạnh trong điều trị ung thư và mô hình pharmacophore cho các chất ức chế NorA nhưng không ức chế P-gp trong điều trị nhiễm trùng.
2. Xây dựng các mô hình máy tính dựa trên cấu trúc (mô hình tương đồng của Pgp) và thực hiện docking phân tử nhằm xác định các tương tác gắn kết, cũng như ái lực gắn kết của phức hợp phối tử-protein.
3. Sàng lọc các chất “hit” là những ứng viên ức chế P-gp, NorA mới và hiệu quả từ hai thư viện nội bộ và Ngân hàng Thuốc bằng các công cụ máy tính thu được.
4. Đánh giá in vitro khả năng ức chế bơm ngược NorA của các chalcon “hit” nội bộ, qua đó làm giảm sự đề kháng với ciprofloxacin khi phối hợp trên chủng S. aureus SA-1199B (biểu lộ quá mức NorA) và một số chủng SA lâm sàng

MỤC LỤC XÂY DỰNG MÔ HÌNH PHÂN LOẠI VÀ DỰ ĐOÁN CÁC CHẤT ỨC CHẾ BƠM NGƯỢC P-GLYCOPROTEIN, NORA VÀ ỨNG DỤNG TRONG VIỆC SÀNG LỌC CÁC CHALCON CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ BƠM NORA CỦA STAPHYLOCOCCUS AUREUS ĐA ĐỀ KHÁNG THUỐC
Trang
Danh mục các chữ viết tắt, thuật ngữ ………………………………………………………………..i
Danh mục các bảng ……………………………………………………………………………………… ii
Danh mục các hình, đồ thị ……………………………………………………………………………..iv
MỞ ĐẦU ……………………………………………………………………………………………………..1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN …………………………………………………………………………..4
1.1. Tổng quan về các bơm ngược nghiên cứu ………………………………………………….4
1.2. Các chất ức chế bơm ngược đề kháng đa thuốc …………………………………………..8
1.3. Đề kháng kháng sinh ……………………………………………………………………………..12
1.4. Các nghiên cứu trước có liên quan …………………………………………………………..14
1.5. Các thuật toán học máy trong Clementine 12.0 …………………………………………14
1.6. Các công cụ máy tính khác …………………………………………………………………….15
1.7. Thử nghiệm tác dụng ức chế bơm ngược trên các chủng vi khuẩn đề kháng …18
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………………..22
2.1. Đối tượng nghiên cứu …………………………………………………………………………….22
2.2. Phương pháp nghiên cứu in silico ……………………………………………………………26
2.3. Phương pháp nghiên cứu in vitro …………………………………………………………….37
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ………………………………………………………………………………46
3.1. Các mô hình máy tính dựa trên phối tử …………………………………………………….46
3.2. Các mô hình máy tính dựa trên cấu trúc (mô hình tương đồng của P-gp) ……..70
3.3. Sàng lọc in silico trên P-gp …………………………………………………………………….73
3.4. Sàng lọc in silico và thử nghiệm in vitro đánh giá tác dụng ức chế bơm ngược
NorA trên S. aureus của một số chalcon nội bộ ……………………………………………….88
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ……………………………………………………………………………99
4.1. Các mô hình máy tính dựa trên phối tử …………………………………………………….99
4.2. Mô hình tương đồng của P-gp ……………………………………………………………….1104.3. Sàng lọc in silico …………………………………………………………………………………111
4.4. Thử nghiệm in vitro …………………………………………………………………………….112
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……………………………………………………………………..115
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN
THAM KHẢ O
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc của P-gp chuột: (A) mặt trước và (B) mặt sau. Các domain xuyên
màng và domain gắn kết nucleotid lần lượt được đánh dấu từ TM 1-12 và NBD
1-2. Nửa N tận và nửa C tận lần lượt được tô màu vàng và xanh. Các TM 4-5
và TM 10-11 tạo thành các giao diện xoắn vào nhau giúp ổn định hình thể hưởng
vào trong. Các thanh ngang đại diện cho vị trí xấp xỉ của lớp lipid kép “Nguồn:
Aller S. G., Yu J., Ward A., et al., 2009” [4] ……………………………………………..6
Hình 1.2. Giản đồ cấu trúc của họ các protein bơm ngược đề kháng đa thuốc MFS
được tạo ra bằng phần mềm UCSF Chimera 1.10 từ lactose permease của E. coli
(LacY) “Nguồn: Schindler B. D., Kaatz G. W., 2016” [161] ………………………8
Hình 2.1. Quy trình nghiên cứu của đề tài ……………………………………………………..22
Hình 2.2. Bố trí thử nghiệm in vitro xác định MIC của ciprofloxacin (Ci) trên các
chủng S. aureus SA-1199 và SA-1199B khi vắng mặt và khi có mặt chất thử
nghiệm X ở các nồng độ khác nhau (A, B μg/mL), qua đó đánh giá khả năng ức
chế bơm ngược NorA của SA của chất thử nghiệm. Trong mỗi hàng ngang của
đĩa, tất cả các giếng chứa kháng sinh (trừ giếng số 11) được cho cùng lượng và
loại vi khuẩn như giếng kiểm soát C (chứa vi khuẩn nhưng không có kháng sinh)
…………………………………………………………………………………………………………..43
Hình 2.3. Bố trí thử nghiệm in vitro xác định MIC của ciprofloxacin (Ci) trên các
chủng S. aureus phân lập từ lâm sàng khi vắng mặt và khi có mặt chất ức chế
bơm đã biết là PaβN ở nồng độ C = 20 μg/mL, qua đó chọn lọc ra các chủng SA
lâm sàng có biểu lộ quá mức bơm ngược. Trong mỗi hàng ngang của đĩa, tất cả
các giếng chứa kháng sinh (trừ giếng số 11) được cho cùng lượng và loại vi
khuẩn như giếng kiểm soát C (chứa vi khuẩn nhưng không có kháng sinh) ..44v
Hình 2.4. Bố trí thử nghiệm in vitro xác định MIC của ciprofloxacin (Ci) trên các
chủng S. aureus phân lập từ lâm sàng có biểu lộ quá mức bơm ngược, khi vắng
mặt và khi có mặt các chất thử nghiệm X1, X2, …, Xn ở nồng độ C = 20 μg/mL,
qua đó đánh giá khả năng ức chế bơm ngược của các SA lâm sàng của từng chất
thử nghiệm. Trong mỗi hàng ngang của đĩa, tất cả các giếng chứa kháng sinh
(trừ giếng số 11) được cho cùng lượng và loại vi khuẩn như giếng kiểm soát C
(chứa vi khuẩn nhưng không có kháng sinh) …………………………………………..45
Hình 3.1. Đồ thị phân tán của mô hình kết hợp trên các tập dữ liệu: (A) Trên tập huấn
luyện và tập đánh giá nội; (B) Trên tập đánh giá ngoại …………………………….60
Hình 3.2. Bản đồ nhận thức đo lường đa hướng (MDS) của các lớp hoạt tính và các
thông số mô tả. P: Chất ức chế chỉ P-gp; A: Chất ức chế chỉ NorA; D: Chất ức
chế cả P-gp và NorA; N: Chất không ức chế cả P-gp và NorA; dia: diameter;
BP2: BCUT_PEOE_2; GP2: GCUT_PEOE_2; bJ: balabanJ; QVF:
Q_VSA_FNEG; A2m: ATSC2m; A4m: ATSC4m; A1s: ATSC1s; AA6v:
AATSC6v; AA4s: AATSC4s; M4s: MATS4s; SpM: SpMAD_DzZ; ASP3:
ASP-3; AVP6: AVP-6; nHCs: nHCsatu; minHCs: minHCsatu; EBPnsd:
ETA_BetaP_ns_d; MDEO22: MDEO-22 ……………………………………………….63
Hình 3.3. Bản đồ nhận thức phân tích tương hợp (CA) của các lớp hoạt tính và các
dấu vân tay. P: Chất ức chế chỉ P-gp; A: Chất ức chế chỉ NorA; D: Chất ức chế
cả P-gp và NorA; N: Chất không ức chế cả P-gp và NorA; MFP128:
MACCSFP128; MFP144: MACCSFP144; PFP2: PubchemFP2 ……………….64
Hình 3.4. Mô hình pharmacophore chất ức chế P-gp mạnh (F1, F2, F3: Nhóm kỵ
nước; F4: Nhóm nhận liên kết hydro; V: Giới hạn thể tích): (A) Các khoảng
cách và góc; (B) Với sự hiện diện của các chất có hoạt tính (aripiprazol, ebastin,
tariquidar và elacridar) …………………………………………………………………………67vi
Hình 3.5. Mô hình pharmacophore chất ức chế NorA nhưng không ức chế P-gp (F1,
F2: Yếu tố vòng thơm/vòng Pi; F3: Nhóm kỵ nước; F4: Nhóm cho liên kết hydro;
V: Giới hạn thể tích): (A) Các khoảng cách và góc; (B) Với sự hiện diện của
các chất có hoạt tính (20, 21, 30) …………………………………………………………..69
Hình 3.6. Đồ thị Ramachandran của mô hình tương đồng P-gp tốt nhất, trong đó các
vùng được ưa thích nhất (the most favoured regions), các vùng được cho phép
thêm (the additional allowed regions), các vùng được cho phép rộng rãi (the
generously allowed regions) và các vùng không được cho phép (the disallowed
regions) được ký hiệu lần lượt là [A,B,L]; [a,b,l,p]; [~a,~b,~l,~p] và [XX]. Khu
vực màu đậm hơn tượng trưng cho kết hợp phi-psi được ưa thích hơn ……….72
Hình 3.7. Mô hình tương đồng tốt nhất của P-gp với vị trí gắn kết phối tử QZ59-RRR
(cyclic-tris-(R)-valineselenazol) được dự đoán bởi I-TASSER ………………….72
Hình 3.8. Đồ thị phân tán của các tập dữ liệu liên quan cho mục đích sàng lọc in
silico chất ức chế và chất không ức chế P-gp, dựa trên 02 thành phần chính đầu
tiên …………………………………………………………………………………………………….74
Hình 3.9. Đồ thị phân tán của các tập dữ liệu liên quan cho mục đích dự đoán in silico
hoạt tính ức chế P-gp, dựa trên 02 thành phần chính đầu tiên ……………………79
Hình 3.10. Năm chalcon thỏa pharmacophore chất ức chế P-gp mạnh (F1, F2, F3:
Nhóm kỵ nước; F4: Nhóm nhận liên kết hydro; V: Giới hạn thể tích): F58 (tím);
F59 (cam); F89 (vàng); F90 (đỏ); F91 (xanh dương) ……………………………….83
Hình 3.11. Bốn chalcon thỏa pharmacophore chất ức chế NorA mà không ức chế Pgp (F1, F2: Yếu tố vòng thơm/vòng Pi; F3: Nhóm kỵ nước; F4: Nhóm cho liên
kết hydro; V: Giới hạn thể tích): F88 (xanh lá); F89 (vàng); F90 (đỏ); F91 (xanh
dương) ……………………………………………………………………………………………….84
Hình 3.12. Hình ảnh docking vào mô hình tương đồng của P-gp của ba chalcon và
ba hợp chất Ngân hàng Thuốc có điểm số docking tốt nhất, cùng với ba chất ức
chế P-gp đã biết là reserpin, tariquidar và elacridar ………………………………….87vii
Hình 3.13. Mô hình tương đồng tốt nhất của NorA với 02 vị trí gắn kết phối tử được
dự đoán: (A) Khoang trung tâm; (B) Walker B ……………………………………….89
Hình 3.14. Hình ảnh docking vào mô hình tương đồng của NorA của bốn chalcon
“hit”: (A) Vào khoang trung tâm; (B) Vào Walker B …………………………..