Xây dựng quy trình cô lập đảo tụy tại Việt Nam và sơ bộ đánh giá hiệu quả của ghép đảo tụy trên chuột bị gây bệnh đái tháo đường typ 1 bằng Streptozocin

Đái tháo đường typ 1 là một bệnh tự miễn được xác định bởi các rối loạn chức năng hệ miễn dịch do tổn thương tế bào beta sản xuất insulin của tiểu đảo tụy. Mặc dù cơ chế bệnh sinh chưa được chứng minh rõ ràng nhưng có những biểu hiện do rối loạn về cấu trúc gen [1] và do ảnh hưởng của một số yếu tố về môi trường [2], ảnh hưởng của chế độ ăn uống [1]. Hậu quả là gây sự tăng cao glucose trong máu và xuất hiện các thể cetonic trong hệ thống tuần hoàn do tế bào thiếu glucose. Nguyên tắc quan trọng trong điều trị là làm hạ glucose trong máu bằng cách bổ sung insulin trong tuần hoàn giúp cho glucose xâm nhập được vào trong tế bào dẫn tới hạn chế sự tăng cao nồng ñộ các thể cetonic. Một phương pháp phổ biến hiện nay là tiêm insulin hàng ngày tùy theo mức độ của nồng độ glucose trong máu bệnh nhân. Điều hạn chế của phương pháp điều trị này là rất khó kiểm soát được biến chứng, trong đó đáng kể nhất là tai biến do dùng insulin quá liều hoặc bị nhiễm toan do dùng insulin không đúng cách và đủ liều. Hơn nữa, phương pháp điều trị này luôn đòi hỏi phải định lượng được nồng độ glucose trong máu. Vì vậy việc theo dõi điều trị gây nhiều tốn kém và phiền phức cho bệnh nhân, đồng thời luôn cần có cán bộ y tế theo dõi. Để hạn chế các tai biến nói trên, việc phát triển các phương pháp ñiều trị mới để kiểm soát lượng insulin đưa vào cơ thể người bệnh trong giới hạn sinh lý là một việc làm cấp bách. Bổ sung tiểu đảo tụy thông qua ghép một số các tiểu đảo ngoại lai là một lựa chọn có nhiều triển vọng. Một ưu điểm quan trọng của phương pháp này là ñơn giản hơn so với ghép cả tuyến tụy và liều thuốc ức chế miễn dịch phải dùng ít hơn [4, 5]. Tuy nhiên, phương pháp này hiện nay chưa ñược nghiên cứu và ứng dụng tại Việt Nam. Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm mục đích. Sửa ñổi, áp dụng phương pháp cô lập ñảo tụy tại labo thí nghiệm bộ môn Dược lý và bộ môn Hóa sinh, Đại học Y Hà Nội. Bước ñầu cấy ghép các đảo tụy cô lập trên chuột cống trắng gây đái tháo đường typ 1 bằng streptozocin.

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Đối tượng

Chuột cống trắng trọng lượng 200 – 250g nuôi tại bộ môn Dược lý, trường Đại học Y Hà Nội.

2. Phương pháp

2.1. Cái tien quy trình cô l¾p và nuôi cay đáo tny

Quy trình cô lập đảo tụy ñược cải tiến theo các bước như sau:

– Xây  dựng  công  thức  pha  chế  dung  dịch Hank’s dùng để cô lập ñảo tụy.

– Xây dựng quy trình cô lập đảo tụy dựa  trên phương pháp cô lập đảo tụy của Labo 6B: 01, Viện Karolinska, Stockholm, Thụy Điển [3]  với  phương châm rút ngắn một số bước có sử dụng các dung dịch đắt tiền, thay thế bằng các công đoạn và dung dịch rẻ tiền hơn mà cụ thể là lược bỏ phần cô lập có sử dụng các dung dịch có tỷ trọng 1077 và 1119 ñể ly tâm cùng với tụy  sau  khi đã ủ với colagenase bằng phương pháp  nhặt và rửa đảo tụy thủ công bằng dung dịch  Hank’s. Sau ñó khoảng 50 – 100 ñảo tụy được  nuôi cấy trong đĩa petri bằng dung dịch RPMI 1640 với nồng độ glucose 11 mM kèm theo 10  % FCS, 100 U/ml penicillin và 100 mg/ml streptomycin sulphate. pH của dung dịch nuôi cấy luôn giữ ở 7.4 bằng cách cho thêm đệm Natri bicar- bonate. Đảo tụy ñược nuôi cấy trong tủ  ấm 370C qua ñêm với 5% carbon dioxide. Chức  năng của đảo tụy được ñánh giá bằng cách định lượng nồng độ insulin của đảo tụy tiết ra trong 1h ngay sau khi đảo tụy được cô lập và ở giờ thứ 24 sau khi ủ. Kết quả được so sánh với kết quả nồng độ insulin của đảo tụy cô lập đo tại Viện  Karolinska trong các nghiên cứu trước ñây của chúng tôi [3].

Ghép đáo tny cô l¾p cho chuột đái tháo  gây bang streptozocin

Chuột cống đái tháo đường được gây bằng cách tiêm màng bụng streptozocin liều 70mg/kg, nuôi trong 15 ngày. Sau khi lấy máu để đo lường insulin và đánh giá nồng độ glucose máu để khẳng định chuột bị đái tháo đường typ 1 (glucose máu > 300mg/dl), chúng tôi tiến hành phẫu thuật, ghép đảo tụy chuột cùng bố, mẹ vào mạc nối lớn. Chuột đái tháo đường typ I sau khi ghép đảo tụy được theo dõi nồng độ glucose máu và insulin máu trong 30 ngày. Nhóm đối chứng chỉ gây đái tháo đường bằng streptozocin, phẫu thuật nhưng không ghép tụy cũng được tiến hành theo dõi song song. Nồng độ glucose máu ñược ño ở các thời điểm: trước phẫu thuật, sau phẫu thuật 5, 15 và 30 ngày.

Định lượng insulin: Insulin trong các mẫu dung dịch hoặc huyết tương ñược giữ ở nhiệt độ – 100C trong vòng 20 ngày rồi đem định lượng trên máy ELISA tại Viện Quân Y 108 bằng“ rat Insulin ELISA kit” của Mercodia, Uppsala Sweden.

Xn lý so li¾u: Kết quả thu thập ñược xử lý bằng  phương  pháp  thống  kê  sử   dụng  t  test student. Khác biệt có ý nghĩa khi giá trị p < 0,05.