XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN TRONG CHẾ PHẨM TỪ NHUNG HƯƠU
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN TRONG CHẾ PHẨM TỪ NHUNG HƯƠU (Cornu Cervi sp.)
Nguyễn Thị Diệu*, Vĩnh Định*
TÓM TẮT :
Đặt vấn đề: Viện Y Dược Học Dân Tộc TP.Hồ Chí Minh gần đây đã sử dụng Nhung hươu để sản xuất một chế phẩm đáp ứng nhu cầu điều trị, được thị trường trong nước tín nhiệm. Tuy đây là vị thuốc kinh điển, nhưng đã được cải tiến dạng bào chế, sử dụng dưới dạng viên nang và để nâng cao chất lượng thuốc, đề tài được thực hiện với mục tiêu sau: – Khảo sát các kỹ thuật phân tích acid amin ứng dụng vào xác định acid amin trong nhung hươu. – Xác định dấu ấn trên sắc ký đồ dấu vân tay (Finger print) của thành phần acid amin trong nhung hươu tươi và khô để phân biệt với các sản phẩm nhung hươu không tự nhiên.- Tối ưu hóa qui trình định lượng acid amin trên các mẫu nhung hươu tươi, khô, bột và chế phẩm viên nang.
Đối tượng & Phương pháp: – Viên nang Nhung hươu chứa 500 mg bột khô nhung hươu của Viện YDHDT. – Các acid amin (AA) chuẩn (12 AA) và chuẩn nội 3-Nitro-L-tyrosin. – Khảo sát thời gian thủy phân protein thành acid amin.- Xây dựng quy trình định lượng đồng thời các acid amin bằng SKLHNC
Kết quả: – Chọn thời gian thủy phân protein thành AA là 24 h. – Định tính bằng phản ứng hóa học: có a-AA (Tyr, Arg) và AA vòng; bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM): phát hiện 7 AA và 5 AA chưa biết, xem như dấu vân tay để định tính AA; bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (SKLHNC): tách được 10 AA là Ala, Arg, Gly, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Val. – Xây dựng quy trình định lượng đồng thời 6 AA bằng SKLHNC với: + Điều kiện sắc ký: Máy SKLHNC Alliance Water 2695; đầu dò PDA Waters 2996; cột Xterra, RP 18 (4,6 x 250 mm; 5 mm); to cột: 40 oC; Vtiêm: 20 µl; tốc độ dòng: 1 ml/phút; λ: 460 nm; pha động: Đệm Natri acetat 25 mM (pH 6,5) chứa 4% DMF (A), Acetonitril (B), chương trình gradient dung môi. + Chuẩn bị các dung dịch: DABS-Cl 4 mM; đệm Natri acetat 25 mM (pH 6,5) chứa 4% DMF; Nitro-tyrosin (nội chuẩn)141,5 µg/ml trong HCl 0,001 N; hỗn hợp chuẩn 6 acid amin trong dung dịch HCl 0,001 N có nồng độ tương tự mẫu cần phân tích: Serin 34,4 µg/ml, Glycin 172,9 µg/ml, Alanin 142,9 µg/ml, Valin 37,5 µg/ml, Leucin 48,7 µg/ml, Phenylalanin 90,6 µg/ml; mẫu thử: hòa cắn thủy phân 24 h với HCl 0,001 N thành 10 ml, lọc, lấy 5 ml pha loãng với nước cất thành 10 ml + Phản ứng tạo dẫn chất: 125 µl mẫu chuẩn (thử), 125 µl nội chuẩn, 250 µl đệm NaHCO3 100 mM (pH 8,3), 1 ml DABS-Cl 4 mM. Lắc rung nhanh, ủ từ 70 – 72 oC / 12 phút. Để nguội. Thêm 3,5 ml Na2HPO4 50 mM (pH 7,0): EtOH (1:1), lắc rung 30 giây, lọc qua màng lọc 0,45 µm. + Đánh giá quy trình phân tích: tính tương tích hệ thống, tính đặc hiệu, độ lặp lại, khoảng tuyến tính, độ đúng: đạt yêu cầu (RSD < 2%). + Áp dụng định lượng 3 lô viên nang Nhung hươu: 010111, 020411 và 030711. Chỉ tiêu khác: tính chất; độ đồng đều khối lượng, mất khối lượng do làm khô, độ rã, độ nhiễm khuẩn. – TCCS đề nghị: tính chất; độ đồng đều khối lượng: KLTB ± 7,5%; mất khối lượng do làm khô: ≤ 5%, độ rã ≤ 30 phút; định tính AA bằng pưhh, SKLM và SKLHNC; định lượng (mg/viên): Ser (³ 0,33), Gly (³ 1,73), Ala (³ 1,43), Val (³ 0,38), Leu (³ 0,47) và Phe (³ 0,88); độ nhiễm khuẩn (DĐVN IV)
Kết luận: Đã chiết xuất, thủy phân và xác định được thời gian thủy phân protein; định tính được AA bằng phản ứng hóa học, SKLM (dấu vân tay) và SKLHNC; xây dựng và đánh giá được quy trình xác định đồng thời 6 AA với kỹ thuật tạo dẫn chất tiền cột với thuốc thử DABS-Cl; ứng dụng định lượng 3 lô viên nang Nhung hươu; khảo sát các chỉ tiêu khác và đã góp phần xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm.
Hy vọng sẽ giúp ích cho các bạn, cũng như mở ra con đường nghiên cứu, tiếp cận được luồng thông tin hữu ích và chính xác nhất