Xây dựng quy trình kỹ thuật phân tích SNP rs1121980 của gen FTO trên bệnh nhân loãng xương cổ xương đùi
Luận văn Xây dựng quy trình kỹ thuật phân tích SNP rs1121980 của gen FTO trên bệnh nhân loãng xương cổ xương đùi.Loãng xương là một bệnh lý của xương, được đặc trưng bởi sự giảm mật độ xương và giảm chất lượng xương, dẫn dến tăng nguy cơ gãy xương. Loãng xương nguyên phát bao gồm loãng xương sau mãn kinh và loãng xương tuổi già. Loãng xương sau mãn kinh thường gặp ở phụ nữ sau mãn kinh hoặc sau cắt bỏ buồng trứng khoảng 5-10 năm, liên quan đến sự thiếu hụt estrogen. Loãng xương tuổi già xuất hiện cả ở nam và nữ trên 70 tuổi [1].
Trên thế giới ước tính có 200 triệu người mắc bệnh loãng xương [2]. Tại Việt Nam, gần 1/3 số phụ nữ trên 50 tuổi có biểu hiện của bệnh loãng xương [3]. Loãng xương rất khó phát hiện trong giai đoạn đầu, thường được phát hiện khi có biến chứng. Biến chứng trầm trọng nhất của loãng xương là gãy xương. Gãy xương làm tăng nguy cơ tử vong và giảm chất lượng cuộc sống. Trên thế giới, có 8,9 triệu trường hợp gãy xương do loãng xương, trung bình cứ 3 giây lại có một trường hợp gãy xương. Trong các loại gãy xương, thường gặp nhất là gãy cổ xương đùi. Gãy cổ xương đùi làm tăng nguy cơ gãy xương tiếp theo lên 2,5 lần, dẫn đến tỷ lệ tử vọng sớm là 8,4 – 30% hàng năm [4]. Hơn một nửa số trường hợp gãy cổ xương đùi xảy ra ở châu Á [5], [6]. Loãng xương có thể xảy ra ở nhiều vị trí, tuy nhiên với mức độ nghiêm trọng của gãy xương cổ xương đùi, việc quan tâm đúng mực đến các bệnh nhân loãng xương ở vị trí cổ xương đùi là vô cùng quan trọng. Phát hiện và điều trị y tế ở giai đoạn loãng xương chưa có biến chứng sẽ giúp giảm thiểu tỷ lệ gãy cổ xương đùi, giảm chi phí y tế, nâng cao đời sống và tuổi thọ của bệnh nhân.
Chẩn đoán loãng xương được thực hiện dựa trên đo mật độ xương (MĐX). Các nghiên cứu phả hệ và các cặp song sinh cùng trứng đã chỉ ra rằng ảnh hưởng của gen đến MĐX là 50-80% [8]. Các nhà khoa học trên thế giới đã tìm ra 56 locus liên quan đến MĐX. Yan Gou và cộng sự (2011) trong nghiên cứu của mình đã chỉ ra 6 SNP của gen FTO có liên quan tới mật độ xương trên quần thể Trung Quốc [9]. Nghiên cứu gần đây của Bích Trần và cộng sự (2013) tại Úc cũng đưa ra kết luận gen FTO có liên quan đến nguy cơ gãy xương ở phụ nữ mãn kinh và gen FTO có thể giúp dự đoán nguy cơ gãy xương do loãng xương, đặc biệt SNP rs1121980 làm tăng nguy cơ gãy xương do loãng xương lên 2 lần [10]. Vì sự liên quan mật thiết của SNP rs1121980 đến loãng xương và gãy xương, trong tương lai dự kiến sẽ có nhiều các nghiên cứu khác tìm hiểu sâu hơn về SNP này. Trong quá trình nghiên cứu, việc thực hiện đúng các kỹ thuật sinh học phân tử đóng vai trò rất quan trọng. Nó không chỉ ảnh hưởng đến chi phí mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả nghiên cứu. Dựa vào thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình kỹ thuật phân tích SNP rs1121980 của gen FTO trên bệnh nhân loãng xương cổ xương đùi” với mục tiêu là:
Hoàn thiện các kỹ thuật sinh học phân tử xác định SNP rs1121980 bao gồm các kỹ thuật RFLP – PCR và giải trình tự gen.
KÉT LUẬN
Các kết quả thu được từ khóa luận này cho thấy quy trình xác định tính đa hình đơn của SNP rs1121980 trên gen FTO bằng phương pháp RFLP-PCR và được kiểm chứng đảm bảo độ chính xác bằng phương pháp giải trình tự gen đã hoàn thiện. Có thể áp dụng vào thực tế để phục vụ những nghiên cứu sâu hơn với cỡ mẫu lớn hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Thị Ngọc Lan, Bệnh học nội khoa 2011
2. Cooper. C, Campion. G và Melton LJ. (1992), “Hip fractures in the elderly: a world-wide projection”, Osteoporos Int. 2(6), tr. 285-9.
3. Hồ Phạm Thục Lan. (2013), “Bệnh loãng xương”, Khoa học phổ thông. 320 (1103), tr. 22 – 24.
4. Karl Insogna và các cộng sự (2014), “Clinician’s guide to prevention and treatment of osteoporosis”, National Osteoporosis Foundation Version 1( Issue 2014).
5. Cooper C., G. Campion, and L.J. Melton, 3rd, (1992). Hip fractures in the elderly: a world-wide projection. Osteoporos Int, 2(6) 285-9.
6. Lau E.M., et al (2001). The incidence of hip fracture in four Asian countries: the Asian Osteoporosis Study (AOS). Osteoporos Int. 12(3): 239-43.
7. Wang P, Wang P, Tang Y, Cai D (2006) 2000-2004 statistics of cost of the management of osteoporotic fracture. Chinese Journal of Osteoporosis (Vol.3).
8. Nguyen T.T.H và các cộng sự (2008), “Peak bone mineral density in VietNamese women”, Osteoprosis Int. 4(1-2:), tr. 9-15.
9. Guo Y và các cộng sự (2011), “The Fat Mass and Obesity Associated Gene, FTO, Is Also associated with Osteoporosis Phenotypes”, PLoS ONE 6(11), tr. 27312.
10. Tran Bich et al (2013). Association between fat-mass-and-obesity- associated (FTO) gene and hip fracture susceptibility. Clin Endocrinol (Oxf).
11. Gullberg, O.Johnell, and J.A. Kanis, (1997). World-wide projections for hip fracture. Osteoporos Int. 7(5), 407-13.
12. Melton III LJ và các cộng sự (1992), ” Perspective: How many women have osteoporosis?”, JBone Miner Res. 7, tr. 1005-10.
13. Karl Insogna và các cộng sự (2014), “Clinician’s guide to prevention and treatment of osteoporosis”, National Osteoporosis Foundation Version 1( Issue 2014).
14. China Health Promotion Foundation (2008), Osteoporosis a Summary Statement of China, White paper China
15. Balfour F. ( 2012), ” China’s “Demographic Tsunami.””, Bloomberg Businessweek.
16. Hồ Phạm Thục Lan và Nguyễn Văn Tuấn. ( 2011), “Sinh Lý học loãng xương”, Thời sựu y học. 62
17. Hồ Phạm Thục Lan. (2013), “Bệnh loãng xương”, Khoa học phổ thông. 320 (1103), tr. 22 – 24.
18. Kanis. J.A và các cộng sự (1994), “The diagnosis of osteoporosis”, J Bone Miner Res. 9, tr. 1137-1141, .
19. Yeo, G.S. and S. O’Rahilly (2012). Uncovering the biology of FTO. Mol Metab, 1(1-2), 32-6.
20. Nguyen H.T., et al (2009). Peak bone mineral density in Vietnamese women. Arch Osteoporos, 4(1-2), 9-15.
21. Tran Bich et al (2013). Association between fat-mass-and-obesity- associated (FTO) gene and hip fracture susceptibility. Clin Endocrinol (Oxf).
22. Gaurav Garg, J.K., Fiona E. McGuigan, (2014). Variation in the MC4R Gene Is Associated with Bone Phenotypes in Elderly Swedish Women. PLOS ONE, February 6, 9 (2).
23. Huong N.T.T., (2012). Osteoporosis a major health problem in Vietnam. 6(1-3),22-28.
24. Guo, S.T., (1992). Performing the exact test of Hardy-Weinberg proportion for multiple alleles. Biometrics, Vol. 48(48 (2), 361-72.
25. Crow, J., (1999). Hardy, Weinberg and language impediments. Genetics. 152 (3)(821-5).
ĐẶT VẤN ĐỀ 10
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Bệnh loãng xương 3
1.1.1 Dịch tễ 4
1.1.2 Chẩn đoán 4
1.1.3 Điều trị loãng xương 5
1.2 Gen liên quan đến loãng xương 6
1.3 FTO 6
1.3.1. Tổng quan về FTO 6
1.3.2 Vị trí và cấu trúc của gen FTO 6
1.3.3 Protein FTO 6
1.4 Tách ADN 7
1.4.1 Tách ADN 7
1.4.2 Bảo quản 8
1.4.3 Đo độ tinh sạch của ADN bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) … 8
1.5 Phân tích SNP rs1121980 bằng phương pháp RFLP – PCR 8
1.6 Điện di 9
1.6.1 Định nghĩa 9
1.6.2 Mục đích 10
1.6.3 Nguyên tắc 10
1.6.4 Các bước thực hiện điện di gel agarose 10
1.7 Giải trình tự gen trực tiếp 11
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
2.1 Đối tượng nghiên cứu 12
2.1.1 Lựa chọn đối tượng nghiên cứu 12
2.1.1.2 Nhóm chứng 12
2.1.2 Quy trình lấy máu 13
2.1.3 Đo mật độ xương theo phương pháp hấp thụ tia X năng lượng kép
(DEXA – Dual Energy X-ray Absorption) 13
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 13
2.2.1 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 04/2014 đến tháng 10/2014 13
2.2.2 Địa điểm nghiên cứu: 13
2.3 Thiết kế nghiên cứu 14
2.4 Phương tiện nghiên cứu 14
2.4.1 Trang thiết bị 14
2.4.2 Hóa chất và sinh phẩm 15
2.5 Các bước tiến hành 16
2.5.1 Tách ADN 16
2.5.2 Xác định kiểu gen bằng phương pháp RELP-PCR 17
2.5.3 Phương pháp giải trình tự gen 19
2.6 Đạo đức nghiên cứu 19
2.7 Quỹ nghiên cứu 20
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21
3.1 Kết quả tách chiết ADN 21
3.2. Kết quả xác định kiểu gen bằng phương pháp RFLP-PCR 23
3.3. Kết quả xác định kiểu gen bằng phương pháp giải trình tự gen 27
3.4. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 28
3.5. Kết quả xác định kiểu gen 29
3.6. Mối liên quan giữa kiểu gen FTO tại SNP rs1121980 với mật độ xương ….30
Chương 4: BÀN LUẬN 31
4.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu 31
4.2 Kết quả tách chiết ADN 33
4.3 Kết quả phân tích SNP rs1121980 của gen FTO theo phương pháp RFLP –
PCR 34
4.4 Kết quả phương pháp giải trình tự gen 35
4.5 So sánh phương pháp RFLP – PCR và phương pháp giải trình tự gen 36
4.6 Đánh giá tỉ lệ kiểu gen và alen ở nhóm nghiên cứu 36
KẾT LUẬN 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Bảng 1.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán loãng xương của WHO 5
Bảng 3.1 Kết quả tách chiết ADN 21
Bảng 3.2 Kết quả phân tích SNP rs1121980 của gen FTO trên bệnh nhân loãng
xương CXĐ 24
Bảng 3.3 Kết quả phân tích SNP rs1121980 của gen FTO trên nhóm chứng ….26
Bảng 3.4 Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 28
Bảng 3.5 Mật độ xương của đối tượng nghiên cứu 29
Bảng 3.6 Phân bố kiểu gen và tần số alen của gen FTO tại SNP rs1121980 trên
nhóm loãng xương CXĐ và nhóm chứng 29
Bảng 3.7 Mối liên quan giữa kiểu gen FTO tại SNP rs1121980 và mật độ xương ở CXĐ (g/cm2) của các nhóm nghiên cứu 30
Hình 1.2 Vị trí gen FTO trên NST 16 6
Hình 1.3 Cấu trúc protein FTO 7
Hình 2.1. Minh họa phản ứng cắt của Enzyme Ndel 18
Hình 3.1 Kết quả điện di sau phản ứng RFLP – PCR 23
Hình 3.2 Kết quả điện di sau ủ enzyme giới hạn 23
Hình 3.3 : Kết quả giải trình tự gen mẫu 1014 27
Hình 3.4: Kết quả giải trình tự gen mẫu 1013 27
Hình 3.5: Kết quả giải trình tự gen mẫu 0024 28