XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG INVITRO CỦA INTERLEUKIN 11 TÁI TỔ HỢP LÊN TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU TỦY XƯƠNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG INVITRO CỦA INTERLEUKIN 11 TÁI TỔ HỢP LÊN TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU TỦY XƯƠNG.Những năm gần đây, ở nước ta các bệnh về máu nói chung và đặc biệt là các bệnh của hệ thống tạo máu ngày càng có xu hướng gia tăng mạnh mẽ. Theo số liệu thống kê chưa đầy đủ từ các cơ sở y tế chuyên điều trị các bệnh về máu như Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương, Bệnh viện Nhi trung ương, Quân y 108, Trung tâm Huyết học và Truyền máu, Bệnh viện Trung ương Huế cho thấy trong vòng 10 năm trở lại đây đã có 7200 ca mắc bệnh về máu, trong đó các bệnh liên quan đến ung thư máu chiếm tỷ lệ khoảng 70%. Nguyên nhân gia tăng các bệnh về máu có thể do ô nhiễm môi trường, hóa chất, các loại virus, các chất độc từ thời chiến tranh, đặc biệt là chất độc da cam đang phát tán hậu quả. Điều đáng lo ngại là bệnh thường được phát hiện hầu hết ở các bệnh nhân còn trẻ tuổi ở lứa tuổi lao động và gây tỷ lệ tử vong cao.
Hiện nay vẫn chưa có phương pháp điều trị hữu hiệu cho các bệnh về máu. Phương pháp điều trị ung thư máu và suy tủy xương được xem là tối ưu nhất hiện nay là ghép tế bào gốc [1, 2]. Khác với phương pháp truyền hoá chất và xạ trị, các phương pháp điều trị bằng ghép tế bào gốc và tế bào gốc tạo máu giúp kéo dài tuổi thọ và đảm bảo chất lượng cuộc sống của người bệnh. Trong trường hợp điều trị bằng kết hợp nhiều phương pháp, ghép tế bào gốc có vai trò cứu vớt, giúp người bệnh có thể chịu được liều lượng hoá chất và tia xạ cao hơn, và do đó có thể nâng cao tỉ lệ kéo dài thời gan lui bệnh. Trong thực tế, ghép tế bào gốc đồng loại giúp chữa khỏi 90% các bệnh nhân bị rối loạn về máu. Tuy nhiên chi phí cho một ca ghép tế bào gốc hiện nay vẫn còn khá cao từ 400 triệu đồng đến hơn 1 tỷ đồng. Hơn nữa để ghép được đòi hỏi giữa người cho và người nhận phải tương hợp về kháng nguyên hòa hợp tổ chức HLA. Với mức chi phí và yêu cầu phù hợp HLA như vậy, thực tế chỉ có khoảng 2-3% người bệnh ung thư máu có đủ điều kiện để thực hiện ghép tế bào gốc. Do vậy, việc nghiên cứu tìm ra các công nghệ, các phương cách, các loại thuốc an toàn và rẻ tiền hơn để cứu sống những bệnh nhân mắc các bệnh về máu là điều hết sức quan trọng và bức thiết hiện nay.
IL-11 là một cytokin có vai trò quan trọng trong quá trình tạo máu [3] và cytokine tạo máu này đã được tiến hành tìm hiểu trên nhiều mô hình hóa trị liệu hay mô hình ghép tủy xương nhằm xác định khả năng ứng dụng như là một yếu tố kích thích tạo tiểu cầu [4]. Với các kết quả thu được khi thử nghiệm trên chuột và khỉ đều cho kết quả khả quan về khả năng kích thích tạo tiểu cầu của IL-11, vào năm 1997, hãng Neumega đã được cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (US Food and Drug Administration – FDA) cấp phép cho việc áp dụng IL-11 tái tổ hợp để kiểm soát bệnh thiếu hụt tiểu cầu và giảm bớt nhu cầu về tiểu cầu trong quá trình truyền máu sau khi hóa trị liệu ức chế tủy đối với những bệnh nhân bị u tủy ác tính – những người có nguy cơ cao về sự thiếu hụt tiểu cầu [5]. Tuy nhiên, giá thành còn cao trên thị trường, chưa phù hợp với người Việt nam.
Trên cơ sở đó, Viện công nghệ sinh học đã nghiên cứu tái tổ hợp và tinh chế thành công IL-11 bằng công nghệ hiện đại. Sản phẩm IL-11 được tạo ra cần phải được đánh giá tính an toàn và hoạt tính sinh học, trước khi sử dụng trên lâm sàng. Chúng tôi sử dụng sản phẩm để nghiên cứu trên mô hình nuôi cấy tế bào gốc sau khi đã có đánh giá tính an toàn chung, độc tính cấp, độc tính bán trường diễn, chí nhiệt tố và các nội độc tố trong mẫu sản phẩm Il-11. Đồng thời hoạt tính IL-11 cũng đã được đánh giá trên tế bào dòng TF-1, tế bào dòng ung thư dòng hồng cầu, mục tiêu của đề tài:
1. Áp dụng quy trình tách và nuôi cấy tế bào gốc tạo máu tủy xương.
2. Đánh giá tác dụng in vitro của IL-11 tái tổ hợp lên tế bào gốc tạo máu tủy xương.
MỤC LỤC XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG INVITRO CỦA INTERLEUKIN 11 TÁI TỔ HỢP LÊN TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU TỦY
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Tế bào gốc 3
1.2. Tế bào gốc tủy xương 4
1.3. Một số yếu tố tham gia quá trình biệt hóa tế bào gốc tạo máu 6
1.3.1. Interleukin-11 8
1.3.2. Interleukin-3 10
1.3.3. GM-CSF 13
1.4. Tách tế bào gốc tạo máu và nuôi cấy in vitro 13
1.5. Đặc điểm chung của bệnh suy tủy xương 14
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16
2.2. Đối tượng và mẫu nghiên cứu 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu 16
2.3.1. Tách tế bào gốc từ các nguồn mẫu 16
2.3.2. Nuôi cấy tế bào gốc 18
2.3.3. Hình thái tế bào 18
2.3.4. Đếm tế bào CD34+ bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy 19
2.3.5. Quy trình thử hoạt tính của IL-11 20
2.3.6. Xử lý số liệu 20
2.4. Vật liệu, dụng cụ nghiên cứu 21
2.4.1. Vật liệu nghiên cứu 21
2.4.2. Dụng cụ nghiên cứu 21
2.4.3. Trang thiết bị phục vụ nghiên cứu 22
2.5. Đạo đức nghiên cứu 23
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24
3.1. Hình thái tế bào 24
3.1.1. Hình thái tế bào trước và sau khi nuôi cấy chưa thử thuốc 24
3.1.2. Hình thái tế bào ở các nhóm thử thuốc 72 giờ 25
3.2. Số lượng tế bào 27
3.2.1. Đánh giá số lượng tế bào trước và sau nuôi cấy 72h của bệnh nhân có tủy bình thường 27
3.2.2. Đánh giá tác dụng tăng sinh của IL-11 trên tế bào gốc tạo máu CD34+ trên bệnh nhân có tủy bình thường. 29
3.2.3. Tác dụng tăng sinh tế bào của IL-11 đối với tế bào gốc CD34+ thu được từ máu ngoại vi 32
3.2.4. Tác dụng tăng sinh tế bào của IL-11 trên tế bào gốc tạo máu CD34+ với tủy xương giảm cả 3 dòng hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu 33
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 38
4.1. Phương pháp tách tế bào gốc và nuôi cấy 38
4.2. Tác dụng của IL-11 lên tế bào gốc tủy xương bình thường 41
4.3. Tác dụng của Il-11 lên tế bào gốc ở tủy xương suy 43
4.4. Tác dụng của IL-11 lên tế bào gốc làm giàu ở máu ngoại vi 44
KẾT LUẬN 46
KIẾN NGHỊ 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt
IL-11 Interleukine-11 Interleukin-11
CD Cluster Of Differentiation Cụm biệt hóa
BC Bạch cầu
HC Hồng cầu
TC Tiểu cầu
HLA Human Leukocyte Antigen Kháng nguyên bạch cầu người
FDA Food and Drug Administration Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa kỳ
GM-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating factor Yếu tố kích thích tạo cụm bạch cầu hạt và đại thực bào
SCF Stem Cell Factor Yếu tố tế bào gốc
IL-3 Interleukine -3 Interleukin-3
OD Optical Density Mật độ quang học
TBG Tế bào gốc
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: So sánh số lượng tế bào BC trước và sau nuôi cấy 72h 27
Bảng 3.2: Số lượng tế bào CD34+ trước và sau nuôi cấy 72h 28
Bảng 3.3: So sánh số lượng tế bào CD34+ ở các nhóm nghiên cứu với nồng độ IL-11 là 1ng/ml 29
Bảng 3.4: So sánh số lượng tế bào CD34+ ở các nhóm nghiên cứu với nồng độ IL-11 là 10ng/ml 30
Bảng 3.5: So sánh số lượng tế bào CD34+ ở các nhóm nghiên cứu với nồng độ IL-11 là 50 ng/ml 31
Bảng 3.6: So sánh số lượng tế bào CD34+ ở các nhóm nghiên cứu với nồng độ IL-11 là 50 ng/ml 32
Bảng 3.7 Số lượng tế bào HC, BC, TC máu ngoại vi ở bệnh nhân suy tủy 33
Bảng 3.8: Số lượng tế bào trước và sau nuôi cấy 72h ở bệnh nhân suy tủy 33
Bảng 3.9: Số lượng tế bào CD34+ trước và sau nuôi cấy 72h ở bệnh nhân suy tủy 34
Bảng 3.10: Số lượng CD34+ trước và sau thử nghiệm IL-11 ở 72h với nồng độ 1ng/ml ở bệnh nhân suy tủy 35
Bảng 3.11: Số lượng CD34+ trước và sau thử nghiệm IL-11 ở 72h với nồng độ 10ng/ml ở bệnh nhân suy tủy 36
Bảng 3.12: Số lượng CD34+ trước và sau thử nghiệm IL-11 ở 72h với nồng độ 50ng/ml ở bệnh nhân suy tủy 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Georges, G.E. and R. Storb, Hematopoietic stem cell transplantation for acquired aplastic anemia. Curr Opin Hematol, 2016. 23(6): p. 495-500.
2. Meissner, J., et al., Autologous hematopoietic stem cell transplantation for intravascular large B-cell lymphoma: the European Society for Blood and Marrow Transplantation experience. Bone Marrow Transplant, 2016.
3. Lemoli, R.M., et al., Interleukin-11 stimulates the proliferation of human hematopoietic CD34+ and CD34+CD33-DR- cells and synergizes with stem cell factor, interleukin-3, and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Exp Hematol, 1993. 21(13): p. 1668-72.
4. Turner, K.J., et al., The role of recombinant interleukin 11 in megakaryocytopoiesis. Stem Cells, 1996. 14 Suppl 1: p. 53-61.
5. Kaye, J.A., FDA licensure of NEUMEGA to prevent severe chemotherapy-induced thrombocytopenia. Stem Cells, 1998. 16 Suppl 2: p. 207-23.
6. Phấn, Đ.T., Tế bào gốc và ứng dụng. 2014. Truyền máu hiện đại ứng dụng trong điều trị bệnh (Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam): p. 26-95.
7. Mountford, J.C., Human embryonic stem cells: origins, characteristics and potential for regenerative therapy. Transfus Med, 2008. 18(1): p. 1-12.
8. Pittenger, M.F., et al., Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science, 1999. 284(5411): p. 143-7.
9. Avery, S., K. Inniss, and H. Moore, The regulation of self-renewal in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev, 2006. 15(5): p. 729-40.
10. Skotnicki, A.B., et al., [Characteristics of the hemopoietic stem cell and its biological marker–the CD34 molecule]. Przegl Lek, 1999. 56 Suppl 1: p. 17-21.
11. Spohn, G., et al., Automated CD34+ cell isolation of peripheral blood stem cell apheresis product. Cytotherapy, 2015. 17(10): p. 1465-71.
12. Ooi, J., et al., Unrelated cord blood transplantation after myeloablative conditioning for adult patients with refractory anemia. Int J Hematol, 2005. 81(5): p. 424-7.
13. De Pauw L (De Pauw, L.A.D.A., D); Donckier V (Donckier, V); Kornreich A (Kornreich, A); Destree M (Destree, M); Demoor F (Demoor, F); Andrien M (Andrien, M); Lambermont M (Lambermont, M); Goldman M (Goldman, M), Isolation and infusion of donor CD34+ bone marrow cells in cadaver kidney transplantation. 1998. 13: p. 34-36.
14. M.C, Y., Overvew of stem cell Biology. 2009: p. 187-199.
15. Christopherson, K.W., 2nd, G. Hangoc, and H.E. Broxmeyer, Cell surface peptidase CD26/dipeptidylpeptidase IV regulates CXCL12/stromal cell-derived factor-1 alpha-mediated chemotaxis of human cord blood CD34+ progenitor cells. J Immunol, 2002. 169(12): p. 7000-8.
16. M, S. and H.E. Broxmeyer, The humoral regulation of hemopoiesis Hematology, 2009. Churchill Elsevier: p. 253-273.
17. Thomson, A.W., The cytokine handbook. Academic Press, 2003.
18. Fitzgerald, K.A., The cytokine factbook. Academic Press, 2001.
19. Klein, B.K., et al., The receptor binding site of human interleukin-3 defined by mutagenesis and molecular modeling. J Biol Chem, 1997. 272(36): p. 22630-41.
20. Ziltener, et al., Carbohydrate dose not modulate the in vivo effects of injected interleukin- 3. 1994. 22: p. 1070-1075.
21. Lindemann, et al., Interleukin – 3 : Structure and function Cancer Investigation 1993. 11: p. 609-623.
22. Niemeyer, C.M., et al., Expression of human interleukin-3 (multi-CSF) is restricted to human lymphocytes and T-cell tumor lines. Blood, 1989. 73(4): p. 945-51.
23. Jamur, M.C. and C. Oliver, Origin, maturation and recruitment of mast cell precursors. Front Biosci (Schol Ed), 2011. 3: p. 1390-406.
24. Rissoan, M.C., et al., Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell differentiation. Science, 1999. 283(5405): p. 1183-6.
25. Zhang, Q.R., [Progress on research and clinical application of interleukin-11 in treatment of leukemia–review]. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi, 2004. 12(5): p. 718-20.
26. McKinley, D., et al., Genomic sequence and chromosomal location of human interleukin-11 gene (IL11). Genomics, 1992. 13(3): p. 814-9.
27. Morris, J.C., et al., Molecular cloning and characterization of murine interleukin-11. Exp Hematol, 1996. 24(12): p. 1369-76.
28. Czupryn, M.J., J.M. McCoy, and H.A. Scoble, Structure-function relationships in human interleukin-11. Identification of regions involved in activity by chemical modification and site-directed mutagenesis. J Biol Chem, 1995. 270(2): p. 978-85.
29. Du, et al., Review of Molecular, Cell Biology, and clinical Use. Blood, 1997. 89: p. 3897-30908.
30. Xu, X.J., et al., [Effects of recombinant human interleukin 11 on hematological malignancy after allogeneic hematopoietic cell transplantation]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 2011. 91(2): p. 100-2.
31. Bhatia, M., V. Davenport, and M.S. Cairo, The role of interleukin-11 to prevent chemotherapy-induced thrombocytopenia in patients with solid tumors, lymphoma, acute myeloid leukemia and bone marrow failure syndromes. Leuk Lymphoma, 2007. 48(1): p. 9-15.
32. Shi, Y., et al., Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: what we do and don’t know. Cell Res, 2006. 16(2): p. 126-33.
33. Hutzschenreuter, F., et al., Granulocyte and granulocyte-macrophage colony stimulating factors for newly diagnosed patients with myelodysplastic syndromes. Cochrane Database Syst Rev, 2016. 2: p. CD009310.
34. Croop, J.M., et al., Large-scale mobilization and isolation of CD34+ cells from normal donors. Bone Marrow Transplant, 2000. 26(12): p. 1271-9.
35. Bosio, A., et al., Isolation and enrichment of stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol, 2009. 114: p. 23-72.
36. Gokcinar-Yagci, B., O. Ozyuncu, and B. Celebi-Saltik, Isolation, characterisation and comparative analysis of human umbilical cord vein perivascular cells and cord blood mesenchymal stem cells. Cell Tissue Bank, 2016. 17(2): p. 345-52.
37. Quillen, K. and E.M. Berkman, Methods of isolation and cryopreservation of stem cells from cord blood. J Hematother, 1996. 5(2): p. 153-5.
38. Reitsma, M.J., B.R. Lee, and N. Uchida, Method for purification of human hematopoietic stem cells by flow cytometry. Methods Mol Med, 2002. 63: p. 59-77.
39. Case, J., A. Rice, and M. Vowels, Conditions affecting the isolation of human umbilical cord blood CD34+ cells. J Hematother, 1996. 5(3): p. 255-60.
40. Sarma, N.J., A. Takeda, and N.R. Yaseen, Colony forming cell (CFC) assay for human hematopoietic cells. J Vis Exp, 2010(46).
41. Heike, T. and T. Nakahata, Ex vivo expansion of hematopoietic stem cells by cytokines. Biochim Biophys Acta, 2002. 1592(3): p. 313-21.
42. Tang, Y., et al., Bone Marrow-derived Endothelial Progenitor Cell Intercellular Adhesion Assay. bio-protocol, 2016. 6.
43. Chung C Doan, N.H.T., Ngoc B Vu, Tam T Nguyen, Hoang M Nguyen, Khue G Nguyen, Si M Do, Ngoc K Phan, Phuc V Pham* ISOLATION, CULTURE AND CRYOPRESERVATION OF HUMAN BONE MARROW – DERIVED MESENCHYMAL STEM CELLS. International journal of plant, animal and enviromental sciences, 2012. 2(2).
44. Sato, N., et al., In vitro expansion of human peripheral blood CD34+ cells. Blood, 1993. 82(12): p. 3600-9.
45. ; Available from: (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10639011). .
46. Donahue, R.E., et al., Peripheral blood CD34+ cells differ from bone marrow CD34+ cells in Thy-1 expression and cell cycle status in nonhuman primates mobilized or not mobilized with granulocyte colony-stimulating factor and/or stem cell factor. Blood, 1996. 87(4): p. 1644-53.