XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NẤM CANDIDA SPP. BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NẤM CANDIDA SPP. BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR
Nguyễn Tú Anh 1,, Lê Thị Thanh Thảo1, Phan Cảnh Trình 1, Nguyễn Minh Thái1, Nguyễn Thị Ngọc Yến2, Tôn Hoàng Diệu 3, Trần 
Mở đầu: Theo Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Mỹ (Centers for Disease Control and Prevention – CDC) và Mạng lưới an toàn chăm sóc sức khỏe quốc gia của Mỹ, Candida spp. được xếp ở vị trí thứ 5 trong các tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và đứng thứ 4 trong số các tác nhân gây nhiễm khuẩn máu. Hiện nay, tại Việt Nam, khuynh hướng dịch chuyển này cũng đang xảy ra với tỉ lệ nhiễm cao nhất ở 04 loài Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis và Candida tropicalis. Tuy nhiên, các phương pháp truyền thống phát hiện các loài thuộc chi Candida tuy dễ thực hiện nhưng có nhiều nhược điểm: phụ thuộc vào yếu tố khách quan, tốn nhiều thời gian, dẫn đến chỉ định điều trị không nhanh chóng và kịp thời. Các phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử có nhiều ưu điểm trong phát hiện, định danh tác nhân vi sinh vật gây bệnh. Mục tiêu: Nghiên cứu này thực hiện với 2 mục tiêu: (1) Xác định và tối ưu hóa điều kiện multiplex PCR phát hiện 04 nấm C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis và C. parapsilosis. (2) Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời 04 loài nấm C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis và C. parapsilosis bằng phương pháp multiplex PCR. Phương pháp: Các mẫu Candida spp. được thu nhận tại Bệnh viện Đại học Y Dược TP. HCM, Bệnh viện Lê Văn Thịnh và Bệnh viện Quân Y 175 từ tháng 10/2020 đến tháng 5/2021. Vi nấm được phát hiện bằng các phương pháp: (1) thử nghiệm tạo ống mầm, (2) phân lập trên môi trường CHROMagar Candida, (3) tối ưu hóa quy trình phát hiện Candida spp. bằng kỹ thuật Multiplex PCR và sử dụng quy trình tối ưu trong phát hiện Candida spp. từ mẫu bệnh phẩm và (4) giải trình tự 5 sản phẩm khuếch đại để kiểm tra tính đặc hiệu. Sau đó, tiến hành so sánh và biện luận kết quả phát hiện Candida spp. bằng 3 phương pháp: thử nghiệm tạo ống mầm, CHROMagar Candida và Multiplex PCR. Kết quả: 40 mẫu bệnh phẩm được phát hiện bằng vào 3 phương pháp: thử nghiệm tạo ống mầm: phát hiện 13 loài C. albicans và 27 loài non-albicans Candida, nuôi cấy môi trường CHROMagar Candida: phát hiện 18 loài C. albicans, 5 loài C. tropicalis, 3 loài C. glabrata và 14 loài non-albicans Candida. Với multiplex PCR: phát hiện 18 loài C. albicans, 7 loài C. tropicalis, 8 loài C. glabrata, 6 loài C. parapsilosis và 1 loài không xác định được. Các thành phần Multiplex PCR phát hiện 4 loài Candida được tối ưu trong 1 ống eppendorf: dung dịch đệm PCR 10 X 2,2 µl; MgSO4 25 mM 0,6 µl; Taq DNA polymerase 5 UI/µl 0,3 µl; dNTP 10 mM 0,5 µl, mồi Falb 5 pmol 0,3 µl; Ralb 5 pmol 0,5 µl; Ftro 5 pmol 0,3 µl; Fpara 5 pmol 0,6 µl; Rpara 5 pmol 0,6 µl; Fgla 5 pmol 0,3 µl; Rgla 5 pmol 0,3 µl; dịch chiết DNA 1 µl; nước khử khoáng vừa đủ 25 µl. Chương trình PCR được tối ưu: giai đoạn biến tính ban đầu 95 oC 5 phút (1 chu kỳ), giai đoạn 2 (40 chu kỳ): biến tính 95 oC 30 giây, gắn mồi 59 oC 30 giây, kéo dài mồi 72 oC 30 giây; giai đoạn kéo dài cuối cùng 72 oC 8 phút (1 chu kỳ).

Tỉ lệ nhiễm nấm Candida  spp.có xu hướng gia tăng rõ rệt trong ba thập kỷ qua, liên quan đến việc sử dụng thuốc chống ung thư, thuốc ức chế miễn dịch, các kháng sinh phổ rộng, ghép tạng, dinh dưỡng qua đường tĩnh mạch, các thiết bị cấy ghép [4]. Trong một số trường hợp, điều trị  thuốc  kháng  nấm  theo  kinh  nghiệm  sẽ  làm bệnh lý trầm trọng hơn.Chẩn đoán và xác định chính  xác  loài Candida gây bệnh là cơ sở trong việc  lựa  chọn  thuốc  kháng  nấm  phù  hợp  giúp tăng hiệu quả điều trị,giảm độc tính, giảm tỉ lệ tử vong và giảm chi phí điều trị cho bệnh nhân. Tuy nhiên, việc chẩn đoánxác định loàiCandida gây bệnh còn hạn chế.Hiện nay, tại Việt Nam, khuynh hướng dịch chuyển này cũng đang xảy ra với  tỉ  lệ  nhiễm  cao  nhất  ở  04  loài  C.  albicans, C.glabrata,  C.  tropicalis  và  C.parapsilosis  [7], [8]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng quy  trình  phát  hiện  nấm  Candida  spp.  bằng phương pháp Multiplex PCRnhằm cung cấp thêm bằng  chứng  khoa  học  chokết  quả  xét  nghiệm trên  bệnh  nhân  nhiễm  nấm  Candida  spp.  một cách  chính  xác  vàkịp thời giúp bác sĩsử dụng phác đồ điều trị kháng nấm nhanh chóng, hiệu quả.