Xây dụng quy trình sản xuất các phiên nhựa thuốc Piperaquine và đánh giá sự nhạy cảm thuốc của Plasmodium Falciparum In Vitro Test

PHẦN A: TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ Nổi BẬT CỦA ĐỂ TÀI
1.    Kết quả nổi bật của đề tài
–    Xây dựng quy trình sản xuất phiến nhựa thuốc PPRQ.
–    Xác định điều kiện bảo quản và thời gian sử dụng các phiến nhựa thuốc PPRQ.
–    Xác định ngưỡng đáp ứng ban đầu của các phân lập p. falciparum in vitro tại la bô và thực địa.
2.    ÁP dụng vào thực tiễn.
–    Đáp ứng nhu cầu cung cấp phiến nhựa thuốc PPRQ (một vật liệu chính) cho các nghiên cứu thử nhạy cảm thuốc in vitro.
–    Ngưỡng đáp ứng ban đầu của các phân lập p. falciparum với PPRQ in vitro.là cơ sở để đánh giá sự thay đổi độ nhạy của KST với thuốc theo thời gian sử dụng.
3.    Đánh giá thực hiện để tài đối chiếu với để cương nghiên cứu đã
được phê duyệt.
–    Tiến âộ thực hiện đúng tiến độ.
–    Mục tiêu nghiên cínr. thực hiện đúng mục tiêu.
–    Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của đề cương’, nghiên cứu đã tạo ra các sản phẩm đúng như dự kiến của đề cương.
–    Đánh giá việc sử dụng kinh phí: sử dụng hợp lý.
4.    Các ý kiến đề xuất.
–    Nên sử dụng bột PPRQ từ một nguồn cung cấp.
–    Nên dùng miếng nilon của WHO để dán nên mặt các giếng thuốc đã được làm khô, tuyệt đối không được phủ giấy bạc nên mặt các giếng thuốc.
–    Nên dùng cân có độ chính xác l/100mg để cân thuốc.
–    Ngay sau khi phiến nhựa thuốc được làm khô, cần thử theo một quy trình đổng nhất với các phân lập tại la bô để kiểm tra tính chính xác của việc cân, pha nhỏ thuốc.
–    Hiệu lực điều trị của CV8 cần được giám sát theo chiều dọc. Sự nhạy cảm in vitro của p.falciparum với CV8 cần được giám sát với từng thuốc riêng biệt, quan trọng là artemisinin và piperaquin.
PHẨN B: BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN cứu I. ĐẶT VẤN ĐỂ
1.    Sản xuất các phiến nhựa thuốc ỏ nước ngoài.
Ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc là một trong những khó khăn kỹ thuật trong phòng chống sốt rét. Tình trạng kháng thuốc của KST đang lan rộng ở nhiều nước trên thế giới trong những năm gần đây, đặc biệt ở vùng Đông Nam châu Á. P.falciparum kháng chloroquin gặp hầu hết ở các nước có SR do P.falciparum. Mức độ kháng tăng dần ở các nước châu Phi, nhất là các nước Tây
Trước những thông báo về kháng thuốc ngày càng tăng về phạm vi và mức độ. WHO thành lập một nhóm các nhà khoa học nghiên cứu về KST kháng thuốc. Các kỹ thuật in vivo và in vitro được thiết kế cho mục đích phát hiện kháng thuốc. Năm 1968, Rieckmann và cộng sự đã giới thiệu kỹ thuật in vitro macrotest. Năm 1978, Rieckmann và cộng sự đã phát triển kỹ thuật kỹ thuật in vitro microtest thay thế kỹ thuật in vitro macrotest. Nguyên liệu chính của kỹ thuật ỉn vitro microtest là các phiến nhựa được nhỏ thuốc trước. Để đảm bảo tính đồng nhất trong nghiên cứu giữa các khu vực, WHO đã thành lập một đơn vị tại Manila, Philippines và hiện nay đơn vị đó chuyển đến Kualalumpur, Malaysia để sản xuất các phiến nhựa thuốc và đóng gói các dụng cụ chuyên dụng (test kit) cho nuôi cấy thử thuốc.
Từ năm 1978 đến nay, WHO đã sản xuất và cung cấp các phiến nhựa thuốc chloroquin, quinin, mefloquin và phối hợp sulfadoxin/pyrimethamin cho tất cả các nước có nhu cầu. Việc vận chuyển các phiến nhựa thuốc và môi trường từ nơi sản xuất đến nơi tiêu dùng thường không được bảo quản lạnh.
Khuynh hướng chung hiện nay để chống kháng thuốc là dùng thuốc phối hợp có một dẫn chất artemisinin, chính vì vậy mà artemisinin và dẫn chất được sử dụng ngày một tăng lên do đó nhu cầu có một phương pháp chuẩn để đánh giá sự nhạy cảm của KST in vitro là cấp thiết. Lúc đầu phiến nhựa artemisinin cũng được sản xuất ở Manila và được chọn là chất đại diện vì dựa trên quan sát thấy hoạt tính sinh học của artemether giảm nhanh trong phiến nhựa do thuốc bị hấp 
thu bởi nguyên liệu nhựa [6]. Với dihyroartemisinin, thời gian tự huỷ quá ngắn. Tuy nhiên, một nghiên cứu so sánh độ nhạy của artemisinin với artemether và dihyroartemisinin trong phiến nhựa mới chuẩn bị cho thấy kết quả giữa các thuốc có mối tương quan chặt. Vì thời gian tự huỷ của các phiến nhựa artemisinin ngắn hơn chloroquin, quinin, mefloquin nên những phiến nhựa này cần được bảo quản trong điều kiện lạnh kể cả khi vận chuyển và điều này không có tính khả thi. Một đề nghị được đưa ra là cung cấp một bộ dụng cụ gồm phiến nhựa không thuốc, bột artemisinin , dung môi và bản hướng dẫn để các phiến nhựa thuốc được sản xuất ở nơi thử.
Những thuốc phối hợp liều cố định, hiệu quả cao, an toàn và giá thành thấp là một nhu cầu cấp bách hiện nay. Những thuốc CV8, artecom và artekin ( gồm 2 thuốc chính là dihyroartemisinin và piperaquin) phần nào đạt được tiêu chí trên. Những thuốc trên đã được thử nghiệm và đưa vào sử dụng ở Trung Quốc, Việt Nam và Cămpuchia. Lý tưởng nhất là các phương pháp in vitro nên được tiến hành trong những vùng mà ở đó những thuốc artemisinin và piperaquin chưa được dùng nhưng có dự tính đưa vào điều trị để có được ngưỡng đáp ứng cơ bản của các phân lập. Nhưng tại thời điểm này (năm 20Ọ2), WHO chưa có phiến nhựa PPRQ để cung cấp.
Theo hướng dẫn của WHO, các phiến nhựa thuốc và môi trường hoá chất dùng cho nuôi cấy cần được bảo quản trong điều kiện chuẩn là 4°c trong tủ lạnh.
2.    Sản xuất các phiến nhựa thuốc ồ trong nước.
Ký sinh trùng sốt rét p.falciparum kháng thuốc là một trở ngại cho công tác phòng chống sốt rét ở Việt Nam và nhiểu nước trên thế giới.
Một số giải pháp được đưa ra nhằm khắc phục tình trạng kháng thuốc là: tăng liều, tìm thuốc mới, phối hợp thuốc, vacxin…
Năm 1996, WHO khuyên nghị nên dùng phối hợp thuốc SR để tăng tỉ lệ điều trị khỏi và hạn chế sự phát triển của KST kháng thuốc [5]. Chính sách này được thể hiện trong tài liệu hướng dẫn điều trị SR của Bộ y tế (1997), đó là phối hợp artemisinin và mefloquine, phối hợp này được dùng để điều trị SR p.falciparum kháng thuốc ở Việt Nam. Sau một thời gian sử dụng, mefloquine đã bộc lộ những nhược điểm, đó là nhiều tác dụng phụ và giá thành cao. Vì vậy phối hợp này ít được người bệnh chấp nhận.
Từ năm 1998, một thuốc phối hợp khác được giới thiệu và dùng để điều trị SR kháng thuốc ở Việt Nam là CV8. Thuốc này gồm 2 thành phần chính: dihydroartemisinin và piperaquine. Năm 2003, thuốc đã được đưa vào điều trị ở tuyến cơ sở.
Theo khuyên nghị của WHO: Tất cả các loại thuốc SR đang được dùng rộng rãi ở tuyến cơ sở cần được giám sát liên tục theo chiều dọc [6].
Đối với artemisinin, WHO đã xây dựng quy trình kỹ thuật in vivo và in vitro cho việc giám sát hiệu lực từ năm 1997 và đã thực hiện ở Việt Nam từ năm 1998 đến nay.
Hiệu lực ỉn vitro của dihydroartemisinin (một dẫn chất của artemisinin) được giám sát và đánh giá gián tiếp thông qua artemisinin. Các phiến nhựa thuốc artemisinin được sản xuất tại Viện SR-KST- CTTƯ theo hướng dẫn của WHO. Các phiến nhựa thuốc chloroquin, quinin, mefloquin và phối hợp sulfadoxin/pyrimethamin được đặt mua từ WHO.
Đối với PPRQ, cho tới nay, chưa có một nghiên cứu về hiệu lực in vitro được tiến hành cũng chưa có một quy trình sản xuất, hướng dẫn bảo quản và sử dụng phiến nhựa thuốc được giới thiệu ở Việt Nam. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng nhận thấy cần phải xác định ngưỡng đáp ứng của các phân lập thực địa với PPRQ tại thời điểm trước khi sử dụng rộng rãi. Số liệu ban đầu sẽ là cơ sở để so sánh với số liệu thu thập được trong quá trình giám sát sau này.
Đáp ứng nhu cầu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình sản xuất phiến nhựa PPRQ, điều kiện bảo quản phiến nhựa thuốc và ngưỡng đáp ứng ban đầu của các phân lập thực địa với thuốc này.
3.    Tính cấp thiết của để tài.
Việc xác định ngưỡng đáp ứng ban đầu của các phân lập p.f thực địa vói PPRQ in vitro tại thời điểm trước khi sử dụng thuốc CV8 rộng rãi và thường xuyên là rất cần thiết và không thể chậm hơn. Chính vì vậy cần có một quy trình sản xuất phiến nhựa thuốc để cung cấp nguyên liệu cho giám sát hiệu lực thuốc ỉn vitro.
4.    Mục tiêu nghiên cứu
4.1.    Xây dựng quy trình sản xuất các phiến nhựa thuốc piperaquine.
4.2.    Đánh giá các điều kiện bảo quản và sử dụng phiến nhựa PPRQ
4.3.    Xác định ngưỡng đáp ứng ban đầu của các phân lập p.f thực địa với PPRQ in vitro.
n. TỔNG QUAN ĐỂ TÀI
I.Tình hình nghiên cứu ngoài nước liên quan đến đề tài.
1.1.    Vai trò của kỹ thuật in vitro trong sự phát triển và đánh giá thuốc.
1.1.1.    Giới thiệu
Các nhà khoa học đã quan tâm đến khả năng có thể đánh giá tác dụng của thuốc SR in vitro từ khi tác nhân gây bệnh cho người-P.falciparum được phát hiện bởi Laveran (1880). Sau đó các NC đã phát triể mạnh và thu được nhiều thành công:
–    Năm 1912, Bass và John đã công bố KT nuôi cấy ngắn ngày KSR SR.
–    Năm 1922, Bass đã quan sát hiệu lực của quinin trên p.falciparum.
–    Năm 1946, Black đã mô tả những thay đổi về hình thể p.falciparum do thuốc
–    Năm 1946, Anfinsen phát triển môi trường nuôi cấy ký sinh trùng SR của động vật có vú.
–    Những năm đầu thập kỷ 60, thế kỷ 20, sự trỗi dậy mối quan tâm về NC sốt rét cơ bản.
–    Năm 1972, Geiman đã thông báo sự phát triển của p.falciparum từ thể nhẫn thành schizont in vitro.
–    Năm 1972, Siddiqui xây dựng mô hình in vitro cho đánh giá hoạt tính thuốc
–    Năm 1979, Lambros đã thành công trong việc đồng thể hoá KST, KT này cung cấp KST ở thể nhẫn cho KT đánh giá hiệu lực thuốc dựa vào sự ức chế schizont.
–    Nuôi cấy ngắn ngày đã thực hiện với p.falciparum và p.vivax, nhưng nuôi cấy dài ngày chỉ thành công với p.falciparum.
MỤC LỤC
Phần A: Tóm tắt các kết quả
1.    Kết quả nổi bật của đề tài    1
2.    Áp dụng vào thực tiễn    1
3.    Đánh giá thực hiện đề tài    1
4.    Các ý kiến đề xuất    1
Phần B: Nội dung báo cáo chi tiết
I.    Đặt    vấn để
1.    Sản xuất các phiến nhựa thuốc ở nước ngoài    3
2.    Sản xuất các phiến nhựa thuốc ở trong nước    4
3.    Tính cấp thiết của đề tài    5
4.    Mục tiêu nghiên cứu    6
II.    Tổng quan đề tài
1.    Tình hình nghiên cứu ngoài nước    6
1.1.    Vai    trò của kỹ thuật in vitro    6
1.2.    Các nghiên cứu thuốc piperaquin    11
1.3.    Các nghiên cứu về hiệu lực điều trị của piperaquin    12
2.    Tình hình nghiên cứu trong nước    13
2.1.    Hệ thống thử nhạy cảm thuốc in vivo và in vi tro    13
2.2.    Các nghiên cứu thuốc piperaquin
2.3.    Các nghiên cứu về hiệu lực điều trị của piperaquin    15
III.    Thời gian và địa điểm    16
IV.    Nguyên liệu    16
V.    Phương pháp    16
1.    Tóm tắt phương pháp    16
2.    Chuẩn bị các phiến nhựa thuốc cho các phân lập thực    địa    17
3.    Chuẩn bị các phiến nhựa thuốc cho các phân lập la bô    18
4.    Đánh giá các điều kiện bảo quản và sử dụng    19
5.    Ngưỡng đáp ứng ban đầu của các phân lập thực địa    22
VI.    Kết quả    23
1.    Quy trình chuẩn bị các phiến nhựa thuốc    23
2.    Đánh giá các điều kiện bảo quản và sử dụng    24
3.    Ngưỡng đáp ứng ban đầu    28
VII.     Bàn luận    29
VIII.     Kết luận và khuyến nghị    31