CÔNG THỨC NHIỄM SẮC THỂ TỦY

KARYOTYPING ANALYSIS OF BONE MARROW SAMPLE

 

NGUYÊN LÝ

Tế bào tủy là những tế bào non có khả năng phân bào. Do đó người ta có thể sử dụng thu hoạch trực tiếp hoặc nuôi cấy trong môi trường nhân tạo mà không cần chất kích thích non hóa. Sau đó dùng chất ức chế phân bào ức chế tế bào ở kỳ giữa của quá trình phân bào lúc này nhiễm sắc thể có hình dạng điển hình nhất, thu hoạch rồi chuẩn bị tiêu bản phân tích cụm nhiễm sắc thể.

CHỈ ĐỊNH

Xét nghiệm này được chỉ định cho tất cả người bệnh mắc bệnh máu ác tính.

CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Kỹ thuật viên xét nghiệm di truyền đã được đào tạo làm kỹ thuật.

Phương tiện – Hóa chất

Phương tiện

Ống falcon 50 ml vô trùng;

Chai nuôi cấy vô trùng;

Bộ dụng cụ đếm bạch cầu;

Lam kính;

Giá để lam;

Ống falcon 15 ml;

Ống nghiệm thủy tinh;

Pipet Pasteur;

Ống eppendorf;

Ống chứa chất chống đông heparin sodium 5ml.

Hóa chất

Môi trường nuôi cấy tế bào (RPMI 1640 có L – glutamin, Hepes);

Huyết thanh bào thai bê (FBS);

Dung dịch ức chế phân bào (Colcemide 0,01 ‰ (10µg/ml));

Dung dịch nhược trương(KCL 0,075M (pH=7,4);

Dung dịch đếm bạch cầu;

Methanol tuyệt đối;

Acid acetic;

Kháng sinh (Streptomicin 10mg/ml + Penecilin 10,000UI/ml).

Bệnh phẩm

2ml tủy được chứa trong ống có chất chống đông heparin sodium.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Nuôi cấy

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:

Cho 45ml môi trường nuôi cấy vào ống falcol 50ml, cho thêm 5ml huyết thanh bào thai bê và 500µl kháng sinh, sau đó trộn đều.

Đếm số lượng tế bào

Ly tâm 1.000 vòng/phút trong 8 phút lấy lớp buffy coat cho vào 3ml môi trường trộn đều và đếm số lượng tế bào tủy trong hỗn dịch.

Tính toán số lượng tế bào cho vào mỗi chai nuôi cấy sao cho số lượng tế bào đạt từ 1 – 4 x 10⁶ tế bào/ml môi trường nuôi cấy.

Chuẩn bị chai nuôi cấy

Mỗi chai nuôi cấy ghi thông tin người bệnh, ngày cấy, ngày thu hoạch. – Trong mỗi chai nuôi cấy cho 10ml môi trường nuôi cấy.

Nuôi cấy tế bào

Nhỏ lượng tế bào như tính toán vào chai nuôi cấy đã chuẩn bị. Lắc nhẹ cho mẫu tan vào môi trường, nới lỏng nắp, đặt nằm trong tủ ấm 37^oC, 5% CO2 / 24 giờ.

Thu hoạch

Nhỏ colcemide: Sau 24 giờ cho vào mỗi chai nuôi cấy 50 µl dung dịch colcemide 0.01⁰/₀₀ (10μg/ml), đặt lại trong tủ ấm trong 15 phút.

Chuẩn bị hóa chất, dụng cụ:

Bật tủ ấm 37ºC, làm ấm dung dịch KCL 0,075M (Số lượng đủ 8ml/mẫu)

Chuẩn bị dung dịch carnoy theo tỷ lệ: 3 methanol: 1 acid acetic

Chuẩn bị ống falcon 15ml, ống nghiệm thủy tinh, pipet thủy tinh theo số lượng ống cấy.

Chuyển toàn bộ huyền dịch ở chai nuôi cấy vào ống falcon 15ml, ly tâm ở máy ly tâm ngang 1.000 vòng/phút trong 8 phút.

Sau khi ly tâm hút bỏ phần dịch nổi ở trên, để lại cặn tế bào (chỉ hút đến cách mặt trên cặn tế bào khoảng 5 mm).

Cho thêm 8ml dung dịch nhược trương đã để ấm 37^oC vào ống ly tâm, trộn nhẹ một vài lần rồi ủ ở bể ấm 37^oC trong 18 phút.

Sau khi ủ 18 phút cho thêm vào mỗi ống 0.5 – 1 ml dung dịch carnoy, trộn nhẹ để 5 – 10 phút.

Lấy ống ra ly tâm lấy cặn, hút bỏ dịch nổi phía trên. Cho thêm vào mỗi ống 10ml dung dịch carnoy trộn đều để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.

Lặp lại bước 7 đến khi cặn tế bào trắng. Tái huyền dịch bằng carnoy.

Nhỏ tiêu bản

Các lam kính sạch rửa sạch ngâm qua nước cất, ngâm lại vào cồn tuyệt đối, chuyển sang ngâm nước cất để lên giá lam cho khô.

Đặt giá lam vào ngăn đá tủ lạnh khoảng 10 phút, sau đó lấy ra để nghiêng 20 – 30⁰ trên giấy thấm.

Nhỏ một giọt huyền dịch vừa pha lên lam kính. Chú ý khi nhỏ tiêu bản để đầu pipet cao hơn mặt lam kính từ 10 – 20 cm.

Để tiêu bản khô tự nhiên trước khi nhuộm.

Lưu ý: Trong trường hợp còn huyền dịch thì lưu vào ống eppendorf để nhỏ thêm tiêu bản khi cần.

Nhuộm Giêmsa

Pha Giêmsa 10% từ Giêmsa mẹ;

Nhuộm tiêu bản 5 – 10phút;

Rửa dưới vòi nước;

Sấy khô trong tủ sấy 60^◦C.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Tiêu bản sau khi nhuộm Giêmsa và băng G, số lượng và cấu trúc của các cặp nhiễm sắc thể sẽ được khảo sát trên kính hiển vi ở độ phóng đại 1.000 lần và được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng.

Một số quy tắc trong khi phân tích:

Thừa nhiễm sắc thể: có từ 2 cụm kỳ giữa trở lên thừa cùng 1 nhiễm sắc thể.

Thiếu nhiễm sắc thể: có từ 3 cụm kỳ giữa trở lên thiếu cùng 1 nhiễm sắc thể.

Bất thường cấu trúc: có từ 2 cụm trở lên mang cùng 1 bất thường.

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Vấn đề	Nguyên nhân	Xử trí
Không có cụm kỳ giữa (cụm mitose), ít cụm.	Nồng độ chất chống đông không đúng.	Kiểm tra lại nồng độ chất chống đông.
	Lấy sai chất chống đông, cho mẫu vào dung dịch chống đông: lithium heparin, EDTA, phenolheparin, natricitrat…	Yêu cầu lấy lại mẫu nếu có thể. Nếu không thể lấy lại mẫu có thể rửa lại tế bào bằng môi trường nuôi cấy trước khi nuôi cấy.
	Chuyển mẫu và bảo quản mẫu	Kiểm tra một số vấn đề: thời gian từ khi lấy mẫu tới khi nhận mẫu, nhiệt độ, áp suất, pH môi trường dùng lưu mẫu khi vận chuyển mẫu.
	Nhiệt độ , CO2 trong tủ nuôi cấy không đúng, quá cao hoặc quá thấp.	Kiểm tra lại nhiệt độ, CO2 trong tủ ấm, nếu không đảm bảo phải mời kỹ sư điều chỉnh lại.
	Môi trường nuôi cấy không đầy đủ (L – glutamin không còn hoạt tính, giảm hoạt tính)	Thêm L – glutamin mới.
	Huyết thanh không phù hợp (huyết thanh không hỗ trợ được cho sự phát triển của tế bào (huyết thanh mất hoạt tính) hoặc gây độc cho tế bào)	Sử dụng lô huyết thanh khác, hoặc ống huyết thanh mới (các ống huyết thanh được tách ra từ chai to), loại huyết thanh khác (huyết thanh bào thai bê, huyết thanh bò, huyết thanh AB người).
	Sử dụng đồ thủy tinh (pipet thủy tinh, pipet Pasteur), đồ nhựa bị lỗi(chai nuôi cấy, đĩa petri)…	Thử thay đổi sang loại pipet mới, chai nuôi cấy, đĩa petri mới.
Màng tế bào không vỡ ra được	Thời gian nhược trương không đủ, sai về nồng độ nhược trương.	Rửa lại cặn tế bào bằng dung dịch carnoy tỷ lệ 2: 1.

 

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Margaret J. Barch, (1991), “The ACT Cytogenetics Laboratory Manual”, Raven press.

Phạm Quang Vinh, Đỗ Trung Phấn, (2009), “Cấy máu ngoại vi phân tích nhiễm sắc thể”, “Kỹ thuật huyết học và truyền máu ứng dụng trong lâm sàng”, Nhà xuất bản Y học, pp103 – 110.