Đặc điểm sinh học phân tử của Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập từ người và vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, Hà Nam, năm 2015

Đặc điểm sinh học phân tử của Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập từ người và vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, Hà Nam, năm 2015

Luận án tiến sĩ y học Đặc điểm sinh học phân tử của Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập từ người và vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, Hà Nam, năm 2015.Sử dụng kháng sinh không hợp lý trong bệnh viện cùng với việc sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản để điều trị, phòng bệnh và kích thích tăng trưởng… dẫn tới tình trạng kháng kháng sinh (KKS) của vi khuẩn gia tăng không ngừng và ngày càng trầm trọng. Đặc biệt, sự xuất hiện gần đây của các chủng vi khuẩn gram âm mang gen New Delhi metallo-beta-lactamase-1 (NDM-1) kháng carbapenem (carbapenem là kháng sinh thuộc “nhóm lựa chọn cuối cùng” trong điều trị các trường hợp bị nhiễm trùng do vi khuẩn gram âm sinh enzym ESBLs) [125]
làm cho việc điều trị các bệnh nhiễm trùng nặng do các chủng vi khuẩn gram âm kháng carbapenem ngày càng khó khăn. Trước thực trạng đó, colistin (kháng sinh nhóm polypeptide) đã được sử dụng trở lại như là kháng sinh lựa chọn cuối cùng để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gram âm đa kháng và kháng carbapenem. Mặc dù colistin bị ngừng sử dụng trên người từ những năm 1970 do có độc tính trên thận, nhưng kháng sinh này vẫn được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi.

Năm 2015, Liu và cộng sự lần đầu tiên phân lập được vi khuẩn E. coli mang gen Mediated colistin resistence (mcr-1) kháng colistin từ thịt lợn và phân người tại Trung Quốc. Cùng với phát hiện này tác giả cũng đưa ra giả thuyết về nguồn gốc phát sinh, lan truyền và phổ biến của mcr-1 ở động vật và người. Theo đó, mcr-1 có thể phát sinh từ việc thường xuyên sử dụng colistin trong chăn nuôi, tại đường ruột các vi khuẩn đường ruột phơi nhiễm với colistin, hệ gen của chúng tiến hóa và thu nhận mcr-1 có khả năng đề kháng colistin. Vì vậy, việc sử dụng colistin trong chăn nuôi được cho là đã tạo điều kiện thuận lợi cho các vi khuẩn mang mcr-1 có cơ hội phát triển trong hệ tiêu hóa của động vật và lây lan sang người thông qua plasmid chứa mcr-1 [57]. Hiện nay, mcr-1 đã được ghi nhận ở hầu khắp các nước trên thế giới. Nguyên nhân chính của sự lây lan nhanh chóng này là do gen mcr-1 đã được xác định nằm trên các yếu tố di truyền động như transposon (ISApl1-PAP2-mcr-1- ISApl1:Tn6330) và nhiều loại plasmid [88]. Ngoài ra, các nghiên cứu gần đây đã ghi nhân các chủng E. coli mang đồng thời nhiều gen kháng (mcr-1, blaNDM-9, fosA3, rmtB, blaCTX-M-65 và floR) mã hóa cho tính kháng nhiều nhóm kháng sinh2 quan trọng như colistin, carbapenem, cephalosporin, fluoroquinolon. Các chủng E. coli mang nhiều gen kháng này được phân lập ở thực phẩm sống (thịt gà, thịt lợn), phân người, phân động vật, gia súc và cả ở các bệnh nhân bị nhiễm trùng. Chính vì vậy, sự có mặt của các chủng E. coli mang gen mcr-1 gây bệnh ở người, động vật đã và đang là một cảnh báo lớn đối với sức khỏe cộng đồng. Đặc biệt, khi các chủng vi khuẩn gây bệnh này kháng cùng lúc với carbapenem và colistin thì việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do các vi khuẩn gram âm mang trở thành một thách thức vô cùng lớn.
Tại Việt Nam, nghiên cứu sơ bộ của chúng tôi và một số các nghiên cứu khác đã phát hiện được các trường hợp dương tính với vi khuẩn mang gen mcr-1 kháng colistin ở trong bệnh viện, môi trường, thực phẩm và động vật nuôi [9, 60, 92, 124].
Một số nghiên cứu khác cho thấy colistin là kháng sinh thường được sử dụng trong chăn nuôi gia súc, gia cầm, thủy sản [10, 2]. Thức ăn bị ô nhiễm bởi các chủng vi khuẩn mang gen mcr-1, sự phát tán các chủng này thông qua chuỗi thức ăn (thịt động vật, rau, nước) là những nguy cơ làm xuất hiện và gia tăng tỉ lệ các chủng vi khuẩn gram âm đường ruột mang gen mcr-1 kháng colistin ở người và động vật nuôi. Tuy nhiên, hiện nay, tại khu vực miền Bắc Việt Nam chưa có nghiên cứu đầy đủ nào về vấn đề này trong toàn bộ cộng đồng bao gồm người, động vật nuôi, môi trường tự nhiên xung quanh (thức ăn và nước)-nơi có thể lan truyền vi khuẩn mang các gen kháng do bị ô nhiễm từ các nguồn trong cộng đồng. Vì vậy, đánh giá tình trạng mang gen mcr-1 của các chủng E. coli nằm trên đường tiêu hóa của người, nằm ở các “ổ chứa” của động vật nuôi, của môi trường (thức ăn, nước), đánh giá cách thức lan truyền gen này bằng cách xác định các đặc điểm sinh học phân tử của chúng là vấn đề cần thiết để kiểm soát đồng bộ các nguy cơ phát triển và gia tăng khả năng kháng colistin. Những bằng chứng khoa học này sẽ giúp xác định một số các yếu tố nguy cơ có thể tạo ra các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh đặc biệt nguy hiểm tại Việt Nam, là cơ sở khoa học để đề ra biện pháp ngăn chặn và giảm thiểu sự gia tăng các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh colistin. Xuất phát từ tình hình thực tế cấp thiết đó, chúng tôi tiến hành đề tài:3
Đặc điểm sinh học phân tử của Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập từ người và vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, Hà Nam, năm 2015” với 2 mục tiêu:
1. Xác định tỷ lệ chủng E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ phân người và vật nuôi, thực phẩm, nước tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, Hà Nam, năm 2015.
2. Xác định một số đặc điểm sinh học phân tử chủng E. coli mang gen mcr-1 đã phân lập được

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………………………………………..1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ………………………………………………………4
1.1. Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh …………………………………………………….4
1.1.1. Định nghĩa…………………………………………………………………………………..4
1.1.2. Cơ chế tác dụng……………………………………………………………………………4
1.1.3. Sự đề kháng kháng sinh…………………………………………………………………5
1.1.4. Các nguyên nhân gây gia tăng và lan truyền các chủng vi khuẩn kháng
kháng sinh ………………………………………………………………………………….15
1.1.5. Colistin……………………………………………………………………………………..19
1.2. Vi khuẩn gram âm đường ruột và thực trạng kháng kháng sinh của các vi
khuẩn gram âm đường ruột…………………………………………………………………………25
1.2.1. Vi khuẩn gram âm đường ruột………………………………………………………25
1.2.2. Thực trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn gram âm đường ruột hiện nay…26
1.3. Đặc điểm vi sinh vật học và tình hình kháng colistin của E. coli…………………27
1.3.1. Đặc điểm vi sinh vật học …………………………………………………………….27
1.3.2. Các nghiên cứu về gen mcr-1 kháng colistin của E. coli và các vi khuẩn
gram âm đường ruột trên thế giới và Việt Nam……………………………………28
1.3.3. Một số đặc điểm về gen mcr-1 và plasmid của các chủng E. coli
kháng colistin ……………………………………………………………………………..32
1.4. Các kĩ thuật phát hiện kháng kháng sinh và các kĩ thuật sinh học phân tử sử
dụng trong phát hiện các gen kháng kháng sinh……………………………………………..33
1.4.1. Kĩ thuật phát hiện kháng kháng sinh………………………………………………33
1.4.2. Các kĩ thuật sinh học phân tử nghiên cứu vi khuẩn kháng kháng sinh….34
1.4.3. Kỹ thuật PCR phát hiện gen kháng kháng sinh ………………………………..36
1.4.4. Kỹ thuật RADP PCR…………………………………………………………………..36
1.4.5. Kỹ thuật điện di xung trường………………………………………………………..36
1.4.6. Kỹ thuật Southern blot phân tích hệ gen vi khuẩn…………………………….37
1.4.7. Kỹ thuật Multi Locus Sequence Typing………………………………………….37
1.4.8. Kỹ thuật giải trình tự gen……………………………………………………………..38
1.5. Các vấn đề cần giải quyết trong nghiên cứu …………………………………………….38CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………40
2.1. Địa điểm nghiên cứu……………………………………………………………………………40
2.2. Thiết kế nghiên cứu …………………………………………………………………………….40
2.3. Thời gian nghiên cứu…………………………………………………………………………..40
2.4. Đối tượng nghiên cứu ………………………………………………………………………….40
2.5. Cỡ mẫu nghiên cứu……………………………………………………………………………..41
2.6. Phương pháp lấy mẫu và kỹ thuật xét nghiệm………………………………………….45
2.6.1. Kĩ thuật nuôi cấy và phân lập vi khuẩn…………………………………………..45
2.6.2. PCR phát hiện gen mcr-1……………………………………………………………..46
2.6.3. Kỹ thuật định danh vi khuẩn bằng máy MALDI TOF……………………….48
2.6.4. Kỹ thuật đánh giá nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu ……………………..49
2.6.5. Phân tích mối liên hệ kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE …………………………54
2.6.6. Kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn……………………………55
2.6.7. Kỹ thuật tiếp hợp đánh giá sự lan truyền gen mcr -1 qua plasmid ……….58
2.7. Biến số và chỉ số trong nghiên cứu ………………………………………………………..59
2.8. Phương pháp thu thập thông tin …………………………………………………………….60
2.9. Xử lý và phân tích số liệu …………………………………………………………………….60
2.10. Khống chế sai số……………………………………………………………………………….60
2.11. Đạo đức trong nghiên cứu…………………………………………………………………..60
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU …………………………………………………..62
3.1. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người
và động vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, Thanh Liêm, Hà Nam,
năm 2015…………………………………………………………………………………………………62
3.1.1. Đặc điểm chung về các loại mẫu được thu thập trong nghiên cứu……….62
3.1.2. Tỷ lệ mẫu có chứa chủng E. coli mang gen mcr-1 phân lập được từ
người người, động vật nuôi, thực phẩm và nước ……………………………….63
3.1.3. Tỷ lệ chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 phân lập được từ người,
động vật nuôi, thực phẩm và nước ………………………………………………….64
3.1.4. Mức độ nhạy cảm colistin của các chủng E. coli mang gen mcr-1 ………66
3.1.5. Tỷ lệ phân bố của gen mcr-1 trên NST và plasmid của các chủng E. coli…..673.1.6. Mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1
trong phân người và động vật nuôi, thức ăn và nước………………………….68
3.2. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1
phân lập được trong nghiên cứu…………………………………………………………………..70
3.2.1. Các gen kháng kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1………70
3.2.2. Mối liên hệ về kiểu gen giữa các chủng vi khuẩn mang gen mcr-1 ……..72
3.2.3. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng
kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen………………………………………………..78
3.3. Kết quả xác định đặc điểm plasmid, cơ chế lan truyền qua trung gian plasmid
và cấu trúc di truyền động của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1………..80
3.3.1. Xác định đặc điểm của các plasmid mang gen mcr-1………………………..80
3.3.2. Xác định khả năng lan truyền gen kháng qua trung gian plasmid giữa
các chủng vi khuẩn ………………………………………………………………………85
3.3.3. Xác định cấu trúc của các yếu tố di truyền di động mang gen mcr-1……86
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ………………………………………………………………………..89
4.1. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ
người, vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà huyện Thanh Liêm, Hà Nam
giai đoạn 2014-2015………………………………………………………………………………….89
4.1.1. Một số đặc điểm về quần thể thu thâp mẫu nghiên cứu……………………..89
4.1.2. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ
người, động vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà huyện Thanh
Liêm, Hà Nam giai đoạn 2014-2015 ……………………………………………….90
4.1.3. Mức độ nhạy cảm colistin của các chủng E. coli mang gen mcr-1
kháng colistin ……………………………………………………………………………..92
4.1.4. Sự phổ biến của các chủng E. coli mang gen mcr-1 trên NST và plasmid …..95
4.1.5. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1 tại
cộng đồng trong nghiên cứu…………………………………………………………..96
4.2. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1
phân lập được trong nghiên cứu…………………………………………………………………..98
4.2.1. Các gen kháng kháng sinh ……………………………………………………………984.2.2. Mối liên hệ về kiểu gen của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng kỹ
thuật PFGE ……………………………………………………………………………….100
4.2.3. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng
kỹ thuật giải trình tự toàn bộ bộ gen………………………………………………102
4.3. Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo ………………………………………………..110
KẾT LUẬN…………………………………………………………………………………………..113
ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN …………………………………………………………111
KIẾN NGHỊ………………………………………………………………………………………….115
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Bảng tổng hợp gen KKS của các nhóm KS thường gặp ……………….. 14
Bảng 1.2. Ví dụ một số lasmid mang gen kháng kháng sinh ……………………….. 35
Bảng 2.1. Số lượng mẫu và chủng phân lập được sử dụng trong nghiên cứu….. 42
Bảng 2.2. Tóm tắt phương pháp lấy mẫu và kỹ thuật xét nghiệm…………………. 45
Bảng 2.3. Diễn giải kết quả đọc MIC của các kháng sinh …………………………… 53
Bảng 3.1. Số lượng các loại mẫu thu thập theo các thôn và hộ gia đình tại xã
Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam năm 2015……………….. 62
Bảng 3.2: Tỷ lệ mẫu có chứa chủng E. coli mang gen mcr-1 phân lập được từ
phân người, phân động vật, thực phẩm và nước…………………………. 63
Bảng 3.3. Kết quả thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu colistin của các chủng
E. coli mang gen mcr-1 phân lập được………………………………………. 66
Bảng 3.4. Sự phân bố của các chủng E. coli mang gen mcr-1 nằm trên NST và
plasmid………………………………………………………………………………… 67
Bảng 3.5. Kết quả thử nghiệm nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu với các
chủng E. coli mang gen mcr-1 …………………………………………………. 68
Bảng 3.6. Số lượng các chủng E. coli mang gen mcr-1 đa kháng kháng sinh…. 69
Bảng 3.7. Phân bố các gen KKS theo loại mẫu và tỷ lệ kháng kháng sinh của
các mẫu giải trình tự………………………………………………………………. 71
Bảng 3.8. Tỷ lệ phân bố các STs trong quần thể các chủng E. coli mang gen
mcr-1 phân lập được………………………………………………………………. 79
Bảng 3.9. Các chủng E. coli mang gen mcr-1 có cùng STs chung được phân
lập từ các loại mẫu trong cùng hộ gia đình…………………………………. 79
Bảng 3.10. Số lượng và loại plasmid mang các gen mcr-1……………………………. 81
Bảng 3.11. Các gen KKS cùng nằm trên plasmid mang gen mcr-1………………… 82
Bảng 3.12. Kết quả thử nghiệm tiếp hợp truyền plasmid giữa các chủng vi khuẩn
E. coli mang gen mcr-1 và chủng vi khuẩn nhận E. coli J53……………… 85DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 phân lập được từ
người, động vật nuôi, thực phẩm và nước………………………………… 64
Biểu đồ 3.2: Heatmap sự phân bố của các chủng E. coli mang gen mcr-1 ở 69
hộ gia đình …………………………………………………………………………. 65
Biểu đồ 3.3: Heatmap sự có mặt các gen KKS của các chủng E. coli mang gen
mcr-1 được xác định bằng giải trình tự toàn bộ bộ gen ………………. 70
Biểu đồ 3.4: Biểu đồ Venn các loại replicon của plasmid mang gen mcr-1 của
các chủng E. coli.. ……………………………………………………………….. 8

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cơ chế tác dụng của kháng sinh……………………………………………………4
Hình 1.2: Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn………………………………………….8
Hình 1.3: Các cơ chế truyền gen ngang ……………………………………………………….9
Hình 1.4: Lây truyền kháng kháng sinh qua chuỗi thức ăn …………………………… 18
Hình 1.5: Cơ chế tác dụng của colistin trên màng vi khuẩn Gram âm…………….. 21
Hình 1.6: Biểu đồ phân bố các nước có vi khuẩn mang gen mcr-1 kháng colistin …… 29
Hình 1.7: Cấu trúc của 04 plasmid mang gen mcr-1 bằng giải trình tự của các
chủng E. coli phân lập được: …………………………………………………….. 33
Hình 2.1. Hình ảnh minh họa kết quả pcr phát hiện gen mcr-1 ……………………… 48
Hình 2.2. Các bước phân tích dữ liệu WGS để xác định các đặc điểm phân tử
của chủng mang gen mcr-1……………………………………………………….. 57
Hình 3.1: Hình ảnh đại diện kết quả điện di xung trường của đại diện một số
chủng E. coli mang gen mcr-1 phân lập được ………………………………. 72
Hình 3.2: Cây phả hệ thể hiện mối liên hệ kiểu gen của các chủng E. coli mang
gen mcr-1 phân lập tại Hà Nam …………………………………………………. 73
Hình 3.3: Mối liên hệ về kiểu gen của các chủng E. coli mang gen mcr-1 phân
lập tại Hà Nam (tiếp) ……………………………………………………………….. 74
Hình 3.4: Cây phả hệ thể hiện mối liên hệ kiểu gen của các chủng E. coli mang
gen mcr-1 phân lập tại Hà Nam (tiếp)…………………………………………. 75
Hình 3.5: Mối liên hệ về kiểu gen của các chủng E. coli mang gen mcr-1 phân
lập tại Hà Nam (tiếp) ……………………………………………………………….. 76
Hình 3.6: Mối liên hệ về kiểu gen của các chủng E. coli mang gen mcr-1 phân
lập tại Hà Nam (tiếp) ……………………………………………………………….. 77
Hình 3.7: Cây phân loại core genome và sequence type của các chủng vi khuẩn
E. coli mang gen mcr-1 phân lập tại Hà Nam……………………………….. 78
Hình 3.8: Cấu trúc plasmid IncI2 mang gen mcr-1 ……………………………………… 86
Hình 3.9: Cấu trúc plasmid IncHI2/IncHI2A/IncN mang gen mcr-1………………. 87
Hình 3.10. Cấu trúc di truyền động transposon của 6 mẫu đại diện của gen mcr-1
trên NST của các chủng E. coli phân lập từ phân người, động vật, thức ăn
trong nghiên cứu………………………………………………………………………. 8

Nguồn: https://luanvanyhoc.com

Leave a Comment