Mối liên quan giữa tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân trong đánh giá sàng lọc phôi tiền làm tổ

Luận văn Mối liên quan giữa tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân trong đánh giá sàng lọc phôi tiền làm tổ.Thống kê mới nhất từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO – World Health Organization) cho biết Việt Nam đang là một trong những quốc gia tại khu vực Châu Á – Thái Bình Dương có tỷ lệ vô sinh khá cao [1]. Hiện tại, vô sinh hiếm muộn đang dần trẻ hóa và có diễn biến phức tạp, gây khó khăn và áp lực không nhỏ lên quá trình hỗ trợ và điều trị sinh sản. Theo số liệu từ Trung tâm Hỗ trợ Sinh sản – Bệnh viện Phụ sản Trung ương, nếu như 10 năm trước chỉ tiếp nhận 2-3 cặp vợ chồng có các vấn đề về sức khỏe sinh sản mỗi ngày thì năm 2015 con số này đã tăng lên gấp 20 lần.

Các phương pháp hỗ trợ sinh sản cho thấy sự tiến bộ đáng kể trong hơn 30 năm qua; nhờ đó khả năng điều trị thành công vô sinh hiếm muộn cũng dần tăng lên. Tuy đã có những cải thiện đáng kể nhưng tỷ lệ sinh sau IVF (In Vitro Fertilization – Thụ tinh trong ống nghiệm) vẫn còn tương đối thấp, trung bình chỉ từ 20 – 30% mỗi lần chuyển phôi tươi ở hầu hết các phòng khám [2], [3]. Mặc dù các phương pháp giúp tăng tỷ lệ cấy phôi thành công đã được đề xuất và thực hiện như: chấm điểm hình thái phôi, FISH (Fluorescence in situ hybridization- Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ), CGH (Comparative genomic hybridization- Phương pháp lai so sánh hệ gen), NGS (Next generation sequencing- Giải trình tự gen thế hệ mới), sàng lọc nhiễm sắc thể toàn diện (CCS- Comprehensive chromosome screening), xét nghiệm thụ thể nội mạc tử cung…nhưng phương pháp được nhiều trung tâm ưu tiên sử dụng đến nay vẫn là dựa trên những đánh giá về đặc điểm hình thái. Tuy nhiên, đánh giá hình thái phôi không phản ánh hoàn toàn chất lượng thực của phôi.
Những phôi được chỉ định ở mức hình thái tốt nhất cũng có khả năng không thể làm tổ hoặc không phát triển thành trẻ khỏe mạnh. Một trong những nguyên nhân chính của việc phôi làm tổ thất bại hay bị sảy thai là do sự hiện diện của các bất thường về số lượng nhiễm sắc thể (lệch bội) trong các tế bào phôi.
PGT-A (Preimplantation genetic testing for Aneuploidy/Sàng lọc di truyền trước chuyển phôi) được phát triển để phát hiện những bất thường như vậy trong các mẫu phôi sinh thiết. Dựa trên kết quả PGT-A, bác sĩ lâm sàng2 sẽ xác định và ưu tiên chuyển những phôi bình thường về số lượng nhiễm sắc thể [4]. Dù vậy, vẫn có trường hợp phôi nguyên bội nhưng không thể làm tổ thành công [5]. Do đó, việc kết hợp kết quả xét nghiệm PGT-A với một số yếu tố đánh giá bổ sung trong bước chọn phôi ưu tiên làm tổ là cần thiết để tăng hiệu quả IVF.
Ty thể là bào quan thiết yếu chịu trách nhiệm sản xuất năng lượng trong tế bào, chúng có hệ gen riêng và sao chép độc lập với chu kì tế bào. Số lượng ty thể trong tế bào là một dấu hiệu cho thấy mức độ hoạt động của tế bào đó (tế bào trứng có khoảng 105 bản sao mtDNA, tế bào sinh dưỡng có khoảng 10³- 104 bản sao của mtDNA) [6] và có vai trò quan trọng trong chức năng của tế bào. Gần đây, ngày càng có nhiều nghiên cứu cho thấy mtDNA như một dấu ấn sinh học trong sự làm tổ của phôi. Tuy những báo cáo đó cho thấy hàm lượng mtDNA cao trong phôi nang có liên quan đến khả năng làm tổ kém thì bên cạnh đó một số công trình nghiên cứu khác không đồng thuận với quan điểm này. Các yếu tố gây nhiễu có thể ảnh hưởng đến số lượng bản sao của mtDNA trong phôi nguyên bội.
Cho đến nay, có rất ít nghiên cứu tiến hành xem xét vai trò của hàm lượng mtDNA ảnh hưởng tới kết quả quá trình sàng lọc trước khi chuyển phôi và liệu số bản sao mtDNA có thể được xem là một tiêu chí giúp bác sĩ lâm sàng chọn lọc phôi để chuyển hay không vẫn còn bỏ ngỏ. Ở Việt Nam chưa có trung tâm hỗ trợ sinh sản IVF nào xem xét số liệu về hàm lượng mtDNA trong xét nghiệm PGT-A. Từ đó có thể thấy, nghiên cứu hàm lượng mtDNA trong hỗ trợ sinh sản ở thế giới và Việt Nam là một hướng đi còn khá mới và mở rộng. Xuất phát từ thực tiễn và yêu cầu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Mối liên quan giữa tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân trong đánh giá sàng lọc phôi tiền làm tổ”.
Mục tiêu của đề tài:
 Giải trình tự và xác định tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân của các mẫu
phôi sinh thiết.
 Khảo sát tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân ở các nhóm phôi khác nhau trong xét nghiệm PGT-A. Từ đó, khảo sát sự tương quan giữa chỉ số3 MA (tỷ số ADN ty thể/ADN nhân) và các tiêu chí chọn phôi hiện tại, tiềm năng của chỉ số MA trong việc đánh giá ưu tiên chuyển phôi ở mức độ di truyền.
Nội dung nghiên cứu:
 Nghiên cứu mối tương quan giữa tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân giữa phôi có hình thái tốt và hình thái không tốt.
 Nghiên cứu mối tương quan giữa tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân giữa các nhóm phôi nguyên bội, nhóm phôi lệch bội, thể khảm và thể khảmlệch bội.
 Nghiên cứu mối tương quan tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân giữa phôi hình thái tốt nguyên bội và phôi hình thái tốt lệch bội

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1. Ưu- nhược điểm của một số phương pháp hỗ trợ sinh sản …………. 5
Bảng 1. 2. Hệ thống đánh giá điểm phôi giai đoạn phân chia theo tổ chức
Alpha ……………………………………………………………………………………………….. 11
Bảng 1. 3. Hệ thống đánh giá điểm phôi giai đoạn phôi nang theo Gardner’s
…………………………………………………………………………………………………………. 12
Bảng 1. 4. Ưu và nhược điểm của ba giai đoạn thực hiện sinh thiết phôi …… 14
Bảng 2. 1. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu …………………………………. 29
Bảng 3. 1. Số lượng và tỷ lệ phần trăm (%) tổng số phôi nghiên cứu………… 45
Bảng 3. 2. Số lượng và tỷ lệ phần trăm (%) tổng số phôi có hình thái tốt…… 51DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1. 1. Sơ đồ quy trình PGT- A…………………………………………………………. 7
Hình 1. 2. Hình ảnh time- lapse cho thấy sự phát triển của phôi ở các giai
đoạn phát triển……………………………………………………………………………………… 8
Hình 1. 3. Bộ gen của ty thể động vật có vú mã hóa 13 polypeptit của chuỗi
truyền điện tử ……………………………………………………………………………………. 20
Hình 1. 4. Cơ chế di truyền thắt cổ chai ADN ty thể (mtDNA) ………………… 22
Hình 1. 5. Ion Torrent trên công nghệ bán dẫn……………………………………….. 28
Hình 2. 1. Sơ đồ các bước tiến hành thí nghiệm……………………………………… 31
Hình 2. 2. Tổng quan các bước tạo thư viện…………………………………………… 33
Hình 2. 3. Sơ đồ hóa quy trình hoạt động chuẩn bị khuôn giải trình tự ……… 35
Hình 2. 4. Tinh sạch bằng hạt từ tạo ADN sợi đơn …………………………………. 36
Hình 2. 5. Quy trình xử lý dữ liệu giải trình tự trong phần mềm Torrent Suite
…………………………………………………………………………………………………………. 37
Hình 2. 6. Kết quả giải trình tự phôi 46, XY ………………………………………….. 38
Hình 2. 7. Kết quả giải trình tự phôi 46, XX ………………………………………….. 38
Hình 3. 1. Kết quả điện di sản phẩm sau bước khuếch đại……………………….. 39
Hình 3. 2. Đánh giá tổng quan về chất lượng kết quả giải trình tự của 1 chu kì
PGT-A ………………………………………………………………………………………………. 40
Hình 3. 3. Đánh giá chất lượng kết quả giải trình tự của từng mẫu……………. 41
Hình 3. 4. Đánh giá chất lượng kết quả xử lý số liệu giải trình tự …………….. 42
Hình 3. 5. Hình ảnh phân tích các mẫu sinh thiết phôi…………………………….. 43
Hình 3. 6. Sự phân bố các đoạn đọc trên ty thể ở một số mẫu phôi …………… 44
Hình 3. 7. Sự phân bố chỉ số MA giữa nhóm phôi có hình thái không tốt và
nhóm phôi có hình thái tốt. ………………………………………………………………….. 45
Hình 3. 8. Phôi có 1 nhiễm sắc thể bất thường (NST số 19) …………………….. 46Hình 3. 9. Phôi có 3 nhiễm sắc thể bất thường (NST số 4, 8 và 22) ………….. 46
Hình 3. 10. Phôi có 5 nhiễm sắc thể bất thường (NST số 4, 13, 14, 15, 21) .. 47
Hình 3. 11. Phôi có 13 nhiễm sắc thể bất thường (NST số 3, 4, 5, 9, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 18, 21 và Y)………………………………………………………………….. 47
Hình 3. 12. Sự phân bố số lượng phôi trong từng nhóm theo số NST bị bất
thường……………………………………………………………………………………………….. 47
Hình 3. 13. Sự phân bố chỉ số MA dựa theo nhóm phôi có số NST bị bất
thường……………………………………………………………………………………………….. 48
Hình 3. 14. Sự phân bố số lượng phôi theo mức độ bất thường số lượng NST
…………………………………………………………………………………………………………. 49
Hình 3. 15. Sự phân bố chỉ số MA giữa các nhóm phôi theo mức độ bất
thường NST……………………………………………………………………………………….. 50
Hình 3. 16. Sự phân bố chỉ số MA giữa các nhóm phôi theo trạng thái bất
thường số lượng NST………………………………………………………………………….. 52MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………………………….. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………………………….. 4
1.1. VÔ SINH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP HỖ TRỢ SINH SẢN …………. 4
1.2. TỔNG QUAN VỀ XÉT NGHIỆM SÀNG LỌC DI TRUYỀN
TRƯỚC CHUYỂN PHÔI (PGT- A) ……………………………………………………. 6
1.2.1. Sinh thiết phôi …………………………………………………………………….. 7
1.2.2. Các kỹ thuật phân tích di truyền sàng lọc phôi………………………. 15
1.2.3. Khó khăn của PGT-A…………………………………………………………. 18
1.3. TỔNG QUAN VỀ TY THỂ ……………………………………………………… 19
1.3.1. Hệ gen ty thể và đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể ……………. 19
1.3.2. Chức năng của ty thể………………………………………………………….. 22
1.4. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU VỀ ADN TY THỂ TRONG IVF….. 24
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ADN TY THỂ……………….. 26
1.5.1. Phương pháp định lượng phản ứng chuỗi (quantitative polymerase
chain reaction/qPCR)…………………………………………………………………….. 26
1.5.2. Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS: Next generation
sequencing) ………………………………………………………………………………….. 27
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …. 29
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ……………………………………………………………….. 292.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ………………………………………….. 29
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu …………………………………………………………… 29
2.1.3. Hóa chất ……………………………………………………………………………… 29
2.1.4. Máy móc và trang thiết bị……………………………………………………… 30
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………………………………………….. 30
2.2.1. Thu thập mẫu ………………………………………………………………………. 32
2.2.2. PGT-A………………………………………………………………………………… 32
2.2.3. Phân tích số liệu…………………………………………………………………… 36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………………………….. 39
3.1. KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI THƯ VIỆN ……………………………………….. 39
3.2. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ………………………………………………………. 40
3.2.1. Sơ bộ về chất lượng giải trình tự và bộ số liệu thô……………………. 40
3.2.2. Tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân ở phôi hình thái tốt và hình thái
không tốt ……………………………………………………………………………………… 44
3.2.3. Mối liên quan giữa tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân về hình thái
phôi và bất thường di truyền…………………………………………………………… 46
3.2.4. Mối liên quan tỷ lệ giữa ADN ty thể và ADN nhân trong nhóm phôi
lệch bội và nguyên bội có hình thái tốt…………………………………………….. 50
3.3. THẢO LUẬN …………………………………………………………………………… 52
3.3.1. Tương quan giữa chỉ số MA và hình thái phôi ………………………. 52
3.3.2. Tương quan tỷ lệ chỉ số MA giữa các nhóm phôi nguyên bội và
lệch bội ở phôi có hình thái tốt ……………………………………………………….. 55
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ………………………………………….. 57
4.1. KẾT LUẬN………………………………………………………………………………. 57
4.2. KIẾN NGHỊ ……………………………………………………………………………… 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………………………. 58
PHỤ LỤC………………………………………………………………………………………….. 6