Nghiên cứu bào chế, đánh giá độc tính và một số tác dụng sinh học của cao khô hành đen

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu bào chế, đánh giá độc tính và một số tác dụng sinh học của cao khô hành đen.Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gio mùa, đây la điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng hết sức thuận lợi cho việc phát triển các vùng chuyên canh trồng hành ta. Cây hành ta (Allium ascalonicum L.) là loại cây quen thuộc chủ yếu được sử dụng phổ biến làm gia vị và thực phẩm. Ngoài ra, còn được sử dụng làm thuốc theo kinh nghiệm dân gian để điều trị nhiều loại bệnh liên quan đến tim mạch, đau đầu, hen suyễn, côn trùng cắn, giun sán [1].
Ngày nay, nhiều nghiên cứu đã chứng minh hành ta có nhiều tác dụng sinh học như tăng cường miễn dịch, ức chế tế bao ung thư, hạ lipid máu, hạ glucose máu, điều trị rối loạn trao ngược dạ dày [2]. Ngoài ra, những năm gần đây, các nha khoa học đã nghiên cứu phát triển công nghệ lên men các loại thực vật họ Hành (Liliaceae) nhằm tìm kiếm và tối ưu hoa các hoạt chất cũng như tác dụng sinh học mới trong đo co các dược liệu điển hình như tỏi và hành.

Lên men dược liệu là một quá trình chuyển hóa sinh học dưới tác động của vi sinh vật, enzym hoặc là tự chuyển hóa diễn ra ngay bên trong dược liệu dưới tác động của nhiệt độ, độ ẩm và thời gian. Lên men giúp cho chuyển hóa các chất cao phân tử thành các chất có khối lượng phân tử thấp hơn lam cho chúng trở thành một phân tử mới, không độc, dễ hấp thu hoặc hoạt tính mạnh hơn, thậm chí có hoạt tính hoàn toàn khác với chất ban đầu [3]. Nhiều nghiên cứu đã áp dụng lên men với các dược liệu như lên men tra xanh (Camellia sinensis L.), tỏi (Allium sativum L.) … các sản phẩm sau khi lên men đều tăng ham lượng hoạt chất và tác dụng sinh học. Đồng thời khắc phục được một số nhược điểm về mùi vị khi sử dụng ở dạng tươi (như các dược liệu họ hành), nhờ đo tạo thêm một nguyên liệu tốt cho sản xuất dược phẩm, thực phẩm, góp phần chăm soc va bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
Hiện nay, các nghiên cứu về lên men hanh đen từ hanh ta còn ít va chưa2 toàn diện, từ nghiên cứu về các điều kiện lên men để tối ưu hoa thanh phần hoạt chất cũng như cải thiện tác dụng sinh học hay tìm kiếm tác dụng mới; nghiên cứu sự biến đổi thành phần hóa học; nghiên cứu chiết xuất bào chế cao khô dược liệu bằng các công nghệ mới để tiện sử dụng, tăng tính ổn định của các sản phẩm, đến các nghiên cứu về đánh giá tác dụng sinh học của dạng cao khô [4]. Vì vậy, chưa khai thác hết được tiềm năng va giá trị của hành ta là loại cây trồng khá phổ biến tại Việt Nam. Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài: “Nghiên cứu bào chế, đánh giá độc tính và một số tác dụng sinh học của cao khô hành đen” được thực hiện với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng được quy trình lên men tạo hành đen từ hành ta (Allium ascalonicum L.) quy mô phòng thí nghiệm.
2. Xây dựng được quy trình bào chế, tiêu chuẩn cơ sở và bước đầu đánh giá độ ổn định của cao khô hành đen.
3. Đánh giá được độc tính và một số tác dụng sinh học của cao khô hành đen trên thực nghiệm

MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các chữ, ký hiệu viết tắt trong luận án
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………………………………… 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………………………….. 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY HÀNH TA …………………………………………….. 3
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố………………………………………………… 3
1.1.2. Thành phần hóa học ……………………………………………………………… 4
1.1.3. Tác dụng sinh học va dược lý ………………………………………………. 13
1.2. TỔNG QUAN VỀ LÊN MEN DƯỢC LIỆU ……………………………….. 16
1.2.1. Đặc điểm …………………………………………………………………………… 16
1.2.2. Phân loại……………………………………………………………………………. 18
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men dược liệu…………….. 19
1.2.4. Thay đổi về thành phần hóa học và tác dụng sinh học sau quá trình
lên men dược liệu chi Allium ………………………………………………………… 22
1.3. CÁC GIAI ĐOẠN BÀO CHẾ CAO KHÔ DƯỢC LIỆU………………. 27
1.3.1. Chuẩn bị dung môi, dược liệu………………………………………………. 27
1.3.2. Chiết xuất dược liệu ……………………………………………………………. 27
1.3.3. Loại bớt tạp chất…………………………………………………………………. 28
1.3.4. Cô đặc, sấy khô ………………………………………………………………….. 30
1.4. MỘT SỐ MÔ HÌNH ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC………….. 31
1.4.1. Các mô hình thực nghiệm in vivo …………………………………………. 31
1.4.2. Các mô hình thực nghiệm in vitro ………………………………………… 34
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………….. 37
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ……………………………………………………. 37
2.1.1. Dược liệu nghiên cứu………………………………………………………….. 37
2.1.2. Động vật thí nghiệm……………………………………………………………. 372.1.3. Các dòng tế bào và chủng vi sinh vật kiểm định cho nghiên cứu in
vitro …………………………………………………………………………………………… 37
2.1.4. Thuốc thử, hóa chất và dung môi………………………………………….. 38
2.1.5. Thiết bị nghiên cứu …………………………………………………………….. 40
2.1.6. Địa điểm thực hiện nghiên cứu…………………………………………….. 41
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………………………………………. 41
2.2.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình lên men tạo hanh đen va tiêu
chuẩn chất lượng hanh đen …………………………………………………………… 41
2.2.2. Nghiên cứu bào chế và xây dựng tiêu chuẩn cao khô hanh đen… 48
2.2.3. Nghiên cứu đánh giá độc tính và tác dụng sinh học của cao khô
hanh đen …………………………………………………………………………………….. 53
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu …………………………………………………… 59
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………………………………………………. 61
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH LÊN MEN
TẠO HÀNH ĐEN VÀ TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG HÀNH ĐEN ….. 61
3.1.1. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng cycloalliin trong hành
đen bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao……………………………………………….. 61
3.1.2. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu hành ta làm nguyên
liệu bào chế hanh đen…………………………………………………………………… 65
3.1.3. Kết quả xây dựng quy trình lên men tạo hanh đen ………………….. 69
3.1.4. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của hanh đen…………….. 78
3.1.5. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của hanh đen ………………………………. 83
3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ XÂY DỰNG TIÊU
CHUẨN CAO KHÔ HÀNH ĐEN ……………………………………………………. 86
3.2.1. Kết quả xây dựng quy trình bào chế cao khô hanh đen……………. 86
3.2.2. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của cao khô hanh đen ……… 101
3.2.3. Kết quả đánh giá độ ổn định của cao khô hanh đen ………………. 102
3.3. ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO
KHÔ HÀNH ĐEN ………………………………………………………………………… 103
3.3.1. Kết quả đánh giá độc tính của cao khô hanh đen ………………….. 103
3.3.2. Kết quả đánh giá một số tác dụng sinh học của cao khô hành
đen …………………………………………………………………………………………… 108CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN…………………………………………………………………. 116
4.1. VỀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH LÊN MEN TẠO HÀNH ĐEN VÀ
TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG HÀNH ĐEN ………………………………….. 116
4.1.1. Về việc lựa chọn cycloalliin làm chất đánh dấu ……………………. 116
4.1.2. Về tiêu chuẩn cơ sở hành ta ……………………………………………….. 117
4.1.3. Về xây dựng quy trình lên men tạo hanh đen……………………….. 117
4.1.4. Về nghiên cứu thành phần hóa học của hanh đen………………….. 123
4.1.5. Về xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của hanh đen…………………………. 128
4.2. VỀ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CAO
KHÔ HÀNH ĐEN ………………………………………………………………………… 128
4.2.1. Về điều chế dịch chiết hanh đen …………………………………………. 128
4.2.2. Bào chế cao khô hanh đen bằng phương pháp phun sấy ………… 132
4.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở bột cao khô hanh đen …………………. 138
4.2.4. Đánh giá độ ổn định của cao khô hanh đen ………………………….. 138
4.3. VỀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO
KHÔ HÀNH ĐEN ………………………………………………………………………… 139
4.3.1. Đánh giá độc tính của cao khô hanh đen ……………………………… 139
4.3.2. Đánh giá một số tác dụng sinh học của cao khô hanh đen ……… 141
KẾT LUẬN……………………………………………………………………………………… 146
KIẾN NGHỊ …………………………………………………………………………………….. 148
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Tên bảng Trang
1.1. Các hợp chất flavonoid trong hành ta 5
1.2. Các hợp chất lưu huỳnh hữu cơ trong hanh ta 11
1.3. Các hợp chất saponin trong hành ta 12
1.4. Kết quả thử hoạt tính chống ung thư của hanh đen va hành ta 26
2.1. Danh mục thuốc thử, hóa chất và dung môi sử dụng 38
2.2. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 40
2.3. Chế độ ăn bình thường và giàu chất béo tính trên 100 g thức ăn 57
3.1. Kết quả khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc ký 61
3.2. Diện tích pic của dãy dung dịch cycloalliin chuẩn 63
3.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 64
3.4. Kết quả khảo sát độ đúng của hệ thống sắc ký 65
3.5. Kết quả xác định ham lượng nước của các mẫu hành ta 66
3.6. Kết quả xác định ham lượng tro toàn phần của hành ta 66
3.7. Kết quả định lượng CYC trong các mẫu hành ta 68
3.8. Tom tắt các chỉ tiêu chất lượng của hành ta 69
3.9. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men 70
3.10. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm lên men 72
3.11. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên men 73
3.12. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của loại, nồng độ enzym và thời gian ngâm ủ 75
3.13. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của enzym protease nồng độ 0,03%, ngâm
ủ trong 3 ngay đến ham lượng CYC theo thời gian lên men 76
3.14. Kết quả định lượng flavonoid toàn phần 78
3.15. Kết quả định lượng polyphenol toàn phần 78
3.16. Kết quả định lượng cycloalliin 79
3.17. Kết quả định lượng đường khử 79
3.18. Kết quả định lượng acid amin 80
3.19. Kết quả xác định độ ẩm hanh đen 84
3.20. Kết quả định lượng CYC trong các mẫu hanh đen 85
3.21. Tom tắt các chỉ tiêu chất lượng trong TCCS của hanh đen 86Bảng Tên bảng Trang
3.22. Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến chiết xuất cycloalliin 87
3.23. Ảnh hưởng của dung môi đến chiết xuất cycloalliin 88
3.24. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/dược liệu đến chiết xuất cycloalliin 88
3.25. Ảnh hưởng của số lần chiết đến chiết xuất cycloalliin 89
3.26. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến chiết xuất cycloalliin 90
3.27. Ảnh hưởng của thời gian đến chiết xuất cycloalliin 90
3.28. Kết quả chiết xuất hanh đen quy mô 2 kg/mẻ 92
3.29. Kết quả cô đặc và loại tạp cao lỏng hanh đen 1:1 92
3.30. Thiết kế khảo sát ảnh hưởng của tá dược đến quá trình phun sấy 93
3.31. Ảnh hưởng của loại tá dược đến hiệu suất phun sấy 94
3.32. Thiết kế khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược/chất rắn 96
3.33. Ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược/chất rắn đến phun sấy cao hanh đen 96
3.34. Thiết kế khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch 97
3.35. Ảnh hưởng của nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch đến quá trình phun sấy 98
3.36. Thiết kế khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn/dịch phun 99
3.37. Ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn/dịch phun đến phun sấy cao hanh đen 99
3.38. Thông số quy trình bào chế cao khô hanh đen 101
3.39. Tóm tắt các chỉ tiêu chất lượng trong TCCS của cao khô hanh đen 101
3.40. Ham lượng cycloalliin còn lại của các mẫu cao khô được bảo quản ở
điều kiện dài hạn 102
3.41. Ham lượng cycloalliin còn lại của các mẫu cao khô được bảo quản ở
điều kiện lão hóa cấp tốc 102
3.42. Tỷ lệ chuột sống, chết sau 72 giờ uống cao khô hanh đen 103
3.43. Ảnh hưởng của cao khô hanh đen đối với khối lượng cơ thể thỏ 104
3.44. Chỉ số hồng cầu, huyết sắc tố, bạch cầu, tiểu cầu ở các lô thỏ nghiên
cứu 105
3.45. Nồng độ AST, ALT, creatinin và ure của các lô thỏ 106
3.46. Nhận xét mô bệnh học gan, thận, lách thỏ thí nghiệm 107
3.47. Tỉ lệ % ức chế các dòng tế bao ung thư của các mẫu thử 108
3.48. IC50 của các mẫu nghiên cứu trên bốn dòng tế bao ung thư 108
3.49. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 109Bảng Tên bảng Trang
3.50. So sánh một số chỉ số sinh hóa lipid máu giữa chuột ở nhóm chứng và
mô hình 109
3.51. Chỉ số sinh hóa lipid máu của chuột sau 21 ngay điều trị 110
3.52. Chỉ số lipoprotein cholesterol máu của chuột sau 21 ngay điều trị 111
3.53. Kết quả hoạt tính ức chế α-glucosidase 112
3.54. Chỉ số glucose máu của chuột ở các lô trong đánh giá tác dụng hạ
glucose máu của cao khô hanh đen 113
3.55. Chỉ số sinh hóa lipid của chuột ở các lô trong đánh giá tác dụng hạ
glucose máu của cao khô hanh đen 114
3.56. Chỉ số lipoprotein cholesterol máu của chuột ở các lô trong đánh giá tác
dụng hạ glucose máu của cao khô hanh đen 11

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình Tên hình Trang
1.1. Hình ảnh hành ta 3
1.2. Cấu trúc của các flavonoid phân lập từ hành ta 5
1.3. Công thức hóa học của cycloalliin 6
1.4. Quá trình sinh tổng hợp isoalliin 9
1.5. Cơ chế chuyển hóa isoalliin thành cycloalliin 10
1.6. Các hợp chất chính trong tinh dầu hành ta 11
1.7. Cấu trúc của các saponin phân lập từ hành ta 12
1.8. Sơ đồ cấu tạo thiết bị và quy trình phun sấy 31
2.1. Chuồng nuôi và cho chuột uống thuốc 53
3.1. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử và dung môi pha mẫu 62
3.2. Đồ thị mối quan hệ tuyến tính của diện tích pic và nồng độ cycloalliin
trong khoảng khảo sát 63
3.3. Thân hành ta (Allium ascalonicum L.) 66
3.4. Sắc ký đồ định tính CYC trong hành ta 67
3.5. Sự biến đổi ham lượng CYC theo thời gian lên men 71
3.6. Ảnh hưởng của độ ẩm tới ham lượng CYC trong hành đen 72
3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới ham lượng CYC 74
3.8. Thân hanh ta trước và sau khi lên men 77
3.9. Cấu trúc hóa học của các chất 1 – 9 83
3.10. Sắc ký đồ định tính CYC trong hanh đen 84
3.11. Sơ đồ quy trình điều chế dịch chiết hanh đen 91
3.12. Sơ đồ bào chế cao khô hanh đen bằng phương pháp phun sấy 10