Nghiên cứu đột biến gen CDH1 (E-cadherin) trên bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền

Nghiên cứu đột biến gen CDH1 (E-cadherin) trên bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền.Ung thư dạ dày (UTDD) là loại ung thư thường gặp, có ảnh hưởng to lớn đến sức khỏe cộng đồng. Theo thống kê của Globocan 2018, thì UTDD là loạiung thư phổ biến thứ 5 và là nguyên nhân gây tử vong thứ 3 ở cả hai giới [1] . Hầu hết UTDD là không di truyền, tuy nhiên khoảng 10% các trường hợp UTDD có tính chất gia đình, trong đó UTDD lan tỏa di truyền chiếm 1-3% [2]
Ung thư dạ dày lan tỏa di truyền là bệnh lý di truyền hiếm gặp, đặc trưng bởi mô bệnh học là những tế bào ung thư kém biệt hóa, xâm lấn lan tỏa ở lớp dưới niêm mạc nên khó phát hiện sớm. Biểu hiện lâm sàng trong UTDD lantỏa di truyền là bệnh thường khởi phát khi tuổi còn trẻ (tuổi trung bình pháthiện là 38), tiến triển nhanh, tiên lượng xấu và tỷ lệ tử vong cao, tuy nhiên nếu phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm thì tỷ lệ sống trên 5 năm có thể tăng lên90% [3] .

Trong cơ chế bệnh sinh của UTDD lan tỏa thì việc kiểm soát độ bám dính và tính di động của tế bào là một trong những yếu tố quan trọng trongquá trình tạo thành và tiến triển của khối u. Gen CDH1 quy định tổng hợpprotein E-cadherin có vai trò quan trọng trong việc bám dính và liên kết tế bào phụ thuộc canxi, duy trì sự phân hóa và kiến trúc bình thường của biểumô [4] . Khi xảy ra đột biến trên gen CDH1, dẫn đến suy giảm chức năngcủa E-cadherin làm giảm khả năng bám dính tế bào, gây nên hình thái bấtthường về cấu trúc biểu mô và mất phân cực tế bào. Nhiều nghiên cứu đãchỉ ra rằng, việc mất sự bám dính giữa các tế bào với tế bào là điều kiệntiên quyết dẫn đến sự xâm lấn và di căn của tế bào ung thư [5] . Đột biếngen CDH1 được phát hiện đầu tiên vào năm 1998 bởi Guilford, thông qua phân tích đột biến ở các thành viên mắc UTDD lan tỏa khởi phát sớm trong 3 gia đình người Maori (New Zealand) [6] . Mặc dù, đã có một vài nghiên2cứu trên thế giới về một số gen có liên quan đến UTDD lan tỏa di truyềnnhư CTNNA1, BRCA2, MAP3K6…tuy nhiên, vai trò của các đột biến gennói trên vẫn chưa chắc chắn vì số lượng mẫu nghiên cứu không đủ để xác định mức độ phổ biến và mức độ thâm nhập của gen [7] .Tỷ lệ phát hiện đột biến của gen CDH1 chiếm 30 – 40% trong các gia đình chẩn đoán UTDD lan tỏa di truyền [6] . Vì vậy, việc xác định đột biến gen trong UTDD lan tỏa di truyền hiện được giới hạn ở gen CDH1.
Đặc điểm di truyền của bệnh là theo cơ chế di truyền gen trội trên nhiễm sắc thể thường, do đó một cá thể trong gia đình có bố hoặc mẹ mang đột biến gen thì có 50% cơ hội nhận được đột biến gen từ bố hoặc mẹ. Vì vậy, việc sàng lọc và phát hiện sớm các thành viên gia đình của bệnh nhân mang đột biến gen CDH1 nhưng chưa biểu hiện bệnh là rất cần thiết. Từ đó, có biện pháp phòng bệnh và đưa ra những can thiệp điều trị sớm hiệu quả. Tại Việt Nam, nghiên cứu về đột biến gen CDH1 ở các bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền, cũng như xác định đột biến ở các thành viên gia đình có nguy cơ cao vẫn còn mới mẻ. Với những lý do trên đề tài “Nghiên cứu đột biến gen CDH1 (E-cadherin) trên bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền” được thực hiện với 2 mục tiêu:
1. Phân tích đột biến gen CDH1 và đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng trên bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền.
2. Xác định đột biến gen CDH1 ở các thành viên trong gia đình bệnhnhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền mang đột biến gen CDH1

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………………………………….. 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN……………………………………………………………………. 3
1.1. Ung thư dạ dày lan tỏa di truyền…………………………………………………… 3
1.1.1. Lịch sử phát hiện và dịch tễ học …………………………………………….. 3
1.1.2. Các yếu tố nguy cơ……………………………………………………………….. 4
1.1.3. Đặc điểm lâm sàng……………………………………………………………… 12
1.1.4. Giải phẫu bệnh …………………………………………………………………… 13
1.1.5. Chẩn đoán ung thư dạ dày lan tỏa di truyền …………………………… 17
1.1.6. Chẩn đoán giai đoạn ung thư dạ dày……………………………………… 18
1.1.7. Điều trị và tiên lượng ………………………………………………………….. 20
1.2. Vai trò của gen CDH1 trong ung thư dạ dày lan tỏa di truyền………… 22
1.2.1. Cấu trúc và chức năng của gen CDH1…………………………………… 22
1.2.2. Cơ chế gây bệnh của gen CDH1 trong ung thư dạ dày lan tỏa di truyền.. 25
1.2.3. Đặc điểm di truyền của ung thư dạ dày lan tỏa di truyền…………. 28
1.2.4. Tình hình nghiên cứu về ung thư dạ dày lan tỏa di truyền và đột
biến gen CDH1 ở trên thế giới và Việt Nam………………………….. 30
1.2.5. Quản lý bệnh ung thư dạ dày lan tỏa di truyền do đột biến gen CDH1… 32
1.3. Các phương pháp phát hiện đột biến gen CDH1 …………………………… 36
1.3.1. Khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR………………………………………. 37
1.3.2. Kỹ thuật giải trình tự gen theo phương pháp Sanger……………….. 37
1.3.3. Dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến gen CDH1 bằng phần
mềm phân tích tin sinh học………………………………………………….. 38
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………. 40
2.1. Đối tượng nghiên cứu ……………………………………………………………….. 40
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu……………………………………………….. 412.3. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………………………. 41
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: …………………………………………………………… 41
2.3.2. Cỡ mẫu nghiên cứu …………………………………………………………….. 41
2.3.3. Phương pháp thu thập mẫu ………………………………………………….. 42
2.3.4. Các biến số nghiên cứu ……………………………………………………….. 43
2.3.5. Sơ đồ nghiên cứu ……………………………………………………………….. 45
2.3.6. Phương tiện nghiên cứu ………………………………………………………. 46
2.3.7. Quy trình kỹ thuật phân tích đột biến gen CDH1……………………. 48
2.3.8. Thử nghiệm Clo-Test trong chẩn đoán nhiễm H. Pylori………….. 51
2.3.9. Quy trình kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch…………………………. 52
2.4. Xử lý và phân tích số liệu ………………………………………………………….. 53
2.5. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu ……………………………………………….. 53
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………………….. 55
3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu ………………………………….. 55
3.1.1. Đặc điểm về tuổi, giới, tiền sử bệnh và yếu tố nguy cơ …………… 55
3.1.2. Đặc điểm lâm sàng……………………………………………………………… 58
3.1.3. Đặc điểm tổn thương dạ dày qua nội soi ……………………………….. 60
3.1.4. Phân loại giai đoạn bệnh theo TNM ……………………………………… 61
3.2. Kết quả phân tích gen CDH1 của đối tượng nghiên cứu………………… 61
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA và phản ứng PCR khuếch đại các exon
của gen CDH1……………………………………………………………………. 61
3.2.2. Kết quả phát hiện đột biến và SNP của gen CDH1 …………………. 62
3.2.3. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của đối tượng nghiên cứu
mang đột biến và SNP trên gen CDH1………………………………….. 723.3. Xác định đột biến gen CDH1 ở các thành viên trong gia đình bệnh
nhân mang đột biến gen CDH1. ……………………………………………………. 79
3.3.1. Phả hệ và kết quả phát hiện đột biến gen CDH1 ở các thành viên
trong gia đình…………………………………………………………………….. 79
3.3.2. Đặc điểm về phả hệ và các thành viên gia đình mang đột biến
gen CDH1…………………………………………………………………………. 87
Chƣơng 4: BÀN LUẬN……………………………………………………………………… 91
4.1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu………………………………………… 91
4.2. Đột biến gen CDH1 trên bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền……………. 101
4.3. Đột biến gen CDH1 ở các thành viên trong gia đình bệnh nhân mang
đột biến gen CDH1. …………………………………………………………………… 120
KẾT LUẬN …………………………………………………………………………………….. 134
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại mô bệnh học ung thư biểu mô dạ dày của Tổ chức Y tế
Thế giới năm 2010 và so sánh với phân loại Lauren ………….. 15
Bảng 1.2. Phân loại TNM trong ung thư dạ dày theo AJCC 8th 2017…….. 19
Bảng 1.3. Phân loại giai đoạn bệnh UTDD theo TNM …………………………. 20
Bảng 1.4. Ý nghĩa của các phương pháp đánh giá đột biến gen CDH1 …… 37
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR…………………………………………………. 49
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR …………………………………………. 49
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự…………………………. 50
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt phản ứng PCR cho giải trình tự ……………………. 50
Bảng 2.5. Quy trình xử lý tiêu bản hóa mô miễn dịch…………………………… 52
Bảng 3.1. Phân loại đối tượng nghiên cứu theo tiêu chuẩn IGCLC 2015… 55
Bảng 3.2. Phân bố tuổi và giới của bệnh nhân tham gia nghiên cứu……….. 56
Bảng 3.3. Mối liên quan giữa tuổi phát hiện bệnh với giới tính……………… 56
Bảng 3.4. Tiền sử cá nhân, gia đình và một số yếu tố nguy cơ ………………. 57
Bảng 3.5. Lý do vào viện của đối tượng nghiên cứu…………………………….. 58
Bảng 3.6. Thời gian xuất hiện triệu chứng đầu tiên đến khi vào viện……… 59
Bảng 3.7. Đặc điểm tổn thương dạ dày qua nội soi………………………………. 60
Bảng 3.8. Phân loại giai đoạn bệnh theo TNM…………………………………….. 61
Bảng 3.9. Các SNP được tìm thấy trong nghiên cứu…………………………….. 63
Bảng 3.10. Đột biến và SNP của gen CDH1 tìm được ở 4 bệnh nhân UTDD
lan tỏa di truyền ……………………………………………………………… 64
Bảng 3.11. Dự đoán khả năng gây bệnh của các đột biến sai nghĩa………….. 70
Bảng 3.12. Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân mang đột biến gen CDH1…. 73
Bảng 3.13. Đặc điểm nội soi và mô bệnh học của bệnh nhân mang đột biến74
Bảng 3.14. Phân bố SNP trên các bệnh nhân tham gia nghiên cứu…………… 77Bảng 3.15. Đặc điểm lâm sàng và một số yếu tố nguy cơ……………………….. 77
Bảng 3.16. Đặc điểm của phả hệ mang đột biến gen trong nghiên cứu …….. 87
Bảng 3.17. Tỷ lệ mang đột biến gen CDH1 trong phả hệ gia đình …………… 88
Bảng 3.18. Đặc điểm nội soi và mô bệnh học của các thành viên gia đình
mang đột biến gen CDH1 ………………………………………………… 8

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. (A) Ung thư biểu mô tế bào nhẫn tại chỗ: tuyến với màng nền còn
nguyên vẹn được lót bởi các tế bào hình nhẫn. (B) Sự xâm nhập
của các tế bào hình nhẫn bên dưới biểu mô (đầu mũi tên). (C) Ung
thư biểu mô tế bào nhẫn xâm lấn giai đoạn T1a…………………….. 16
Hình 1.2. Hình ảnh gen CDH1 nằm trên nhánh dài NST 16, gồm 16 exon mã
hóa cho các vùng protein tương ứng ……………………………………. 23
Hình 1.3. Vị trí của E-cadherin và vai trò trong kết dính tế bào…………… 24
Hình 1.4. Các con đường sinh ung thư liên quan đến E-cadherin ………… 25
Hình 1.5. Phức hợp cadherin-catenin và protein APC. ……………………….. 26
Hình 1.6. Con đường Rho-GTPase ………………………………………………….. 27
Hình 1.7. Sơ đồ phả hệ …………………………………………………………………… 29
Hình 1.8. Vị trí và phân loại các dạng đột biến gen CDH1 trong UTDD lan
tỏa di truyền đã được công bố …………………………………………… 30
Hình 3.1. Kết quả PCR exon 9 (A) và exon 13 (B) của gen CDH1, (-):
chứng âm, (+): chứng dương, M: ladder thang chuẩn 100 bp… 62
Hình 3.2. Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến……………………… 65
Hình 3.3. Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến……………………… 66
Hình 3.4. Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến……………………… 67
Hình 3.5. Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến……………………… 68
Hình 3.6. Phân bố đột biến và SNP trên gen CDH1 …………………………… 69
Hình 3.7. Hình ảnh minh họa sử dụng công cụ Polyphen 2 trong dự đoán
khả năng gây bệnh của đột biến sai nghĩa…………………………… 71
Hình 3.8. Hình ảnh minh họa sử dụng công cụ Mutation Taster xác định
khả năng gây bệnh của đột biến ………………………………………… 72
Hình 3.9. Ảnh vi thể UTDD thể lan tỏa của bệnh nhân B4 …………………. 75Hình 3.10. Ảnh vi thể UTDD thể lan tỏa của bệnh nhân B732 ……………… 75
Hình 3.11. Ảnh vi thể UTDD thể lan tỏa bệnh nhân B532……………………. 76
Hình 3.12. Ảnh vi thể UTDD thể lan tỏa của bệnh nhân B151 ……………… 76
Hình 3.13. Phả hệ và kết quả phân tích gen CDH1 của gia đình bệnh nhân B4.. 79
Hình 3.14. Hình ảnh giải trình tự gen CDH1 tại vị trí mang đột biến của
thành viên gia đình B4……………………………………………………… 80
Hình 3.15. Phả hệ và kết quả phân tích gen CDH1 của gia đình bệnh nhân B732 … 81
Hình 3.16. Hình ảnh giải trình tự gen CDH1của thành viên gia đình B732
mang đột biến. ………………………………………………………………… 82
Hình 3.17. Phả hệ và kết quả phân tích gen CDH1 của gia đình bệnh nhân B15183
Hình 3.18. Hình ảnh giải trình tự gen CDH1 của thành viên gia đình B151
mang đột biến …………………………………………………………………. 84
Hình 3.19. Phả hệvà kết quảphân tích gen CDH1của gia đình bệnh nhânB532…. 85
Hình 3.20. Hình ảnh giải trình tự gen CDH1của thành viên gia đình B532
mang đột biến …………………………………………………………………. 86
Hình 4.1. Bản đồ phân bố các đột biến trên gen CDH1…………………….. 10