Nghiên cứu mô hình ung thư buồng trứng thực nghiệm và ảnh hưởng của virus vaccin sởi trên ung thư
Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu mô hình ung thư buồng trứng thực nghiệm và ảnh hưởng của virus vaccin sởi trên ung thư.Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2019, tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong do ung thư tăng cao. Ung thư được xếp hàng đầu và hàng thứ hai về nguyên nhân gây tử vong cho người dưới 70 tuổi ở 112 nước trên tổng 183 nước được thống kê.1 Số liệu ghi nhận ung thư toàn cầu (GLOBOCAL) năm 2020, số ca mới mắc và số ca tử vong do ung thư lần lượt là 2.261.419 và 684.996. Trong đó ung thư buồng trứng (UTBT) đứng thứ 20 với số ca mới mắc và tử vong tương ứng là 313.959 và 207.252 (chiếm 1,6% tổng số ca ung thư mới mắc và 2,1% tổng số ca tử vong do ung thư).2 Dự kiến năm 2030 số ca UTBT mới mắc tăng 55% và số ca chết vì UTBT tăng 67%.
Ung thư buồng trứng được công nhận là một bệnh có nền tảng phân tử riêng biệt và có cơ chế bệnh sinh phức tạp. Dù đã có những tiến bộ đáng kể trong chẩn đoán và điều trị, nhưng tỷ lệ sống thêm của bệnh UTBT vẫn chưa được cải thiện trong nhiều thập kỷ qua.3 Để tối ưu hoá điều trị UTBT thì cần phải hiểu rõ về nguồn gốc tế bào u, cơ chế phát triển của UTBT và sự khác biệt về đặc tính sinh học giữa các loại mô bệnh học UTBT.4 Các dòng tế bào có nguồn gốc từ khối UTBT đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu in vitro về sinh học ung thư; tuy nhiên các mô hình cấy ghép UTBT trên động vật in vivocó thể mang lại những hiểu biết chính xác hơn về đặc điểm phân tử của các khối u nguyên phát và trở thành nền tảng cho các thử nghiệm tiền lâm sàng.5
Hiện nay, điều trị UTBT mang tính cá thể hoá và áp dụng nhiều phương pháp điều trị tiên tiến như liệu pháp điều trị nhắm trúng đích, liệu pháp miễn dịch tế bào và đặc biệt là liệu pháp sử dụng virus gây ly giải tế bào khối u (oncolytic virus, OLV). Tại Việt Nam, liệu pháp OLV sử dụng vaccine virus sởi để nghiên cứu điều trị ung thư trên in vitro và in vivo với nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau như ung thư gan, ung thư phổi, ung thư vú, ung thư máu, ung thư đầu mặt cổ, ung thư tiền luyệt tuyến.6-14 Còn đối với UTBT thì hiện chưa có mô hình cấy ghép dị loài với dòng tế bào UTBT phân lập từ bệnh nhân (ex vivo)được công bố cũng như chưa có nghiên cứu nào đánh giá tác động của virus vaccin sởi trên mô hình thực nghiệm đó. Do vậy tạo mô hình UTBT ex vivocho từng bệnh nhân là cơ sở quan trọng để thử nghiệm liệu pháp OLV của virus vaccine sởi trên ung thư và là sự cần thiết nhằm cá thể hoá trong điều trị UTBT.
Vì vậy chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Nghiên cứu mô hình ung thư buồng trứng thực nghiệm và ảnh hưởng của virus vaccin sởi trên ung thư” với hai mục tiêu sau:
1. Đánh giá kết quả gây ung thư buồng trứng thực nghiệm.
2. Bước đầu đánh giá tác động của virus vaccin sởi trên mô hình ung thư buồng trứng thực nghiệm.
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Ung thư buồng trứng 3
1.1.1. Dịch tễ 3
1.1.2. Cơ chế bệnh sinh ung thư buồng trứng 4
1.1.3. Phân loại mô bệnh học ung thư buồng trứng theo WHO 2020 6
1.1.4. Hoá mô miễn dịch trong chẩn đoán ung thư biểu mô buồng trứng . 7
1.2. Phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư buồng trứng 10
1.2.1. Phân lập và nuôi cấy tế bào 10
1.2.2. Phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư buồng trứng 13
1.3. Mô hình gây ung thư buồng trứng thực nghiệm 17
1.3.1. Các dòng chuột thiếu hụt miễn dịch 17
1.3.2. Mô hình tạo khối u buồng trứng người trên chuột thiếu hụt miễn
dịch 19
1.4. Virus vaccin sởi và liệu pháp tiêu huỷ khối u (OLV) của virus vaccin
sởi trong điều trị ung thư và ung thư buồng trứng 23
1.4.1. Virus vaccin sởi (MeV) và thụ thể của MeV trong liệu pháp tiêu
huỷ khối u 23
1.4.2. Điều trị ung thư và UTBT bằng virus vaccin sởi 25
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 31
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 31
2.1.2. Mẫu bệnh phẩm phân lập tế bào UTBT Error! Bookmark not
defined.
2.1.3. Động vật nghiên cứu 31
2.1.4. Các dòng tế bào dùng trong nghiên cứu 32
2.1.5. Virus vaccin sởi 32
2.1.6. Trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu 33
2.2. Phương pháp nghiên cứu 32
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu 32
2.2.2. Các chỉ tiêu nghiên cứu và tiêu chí đánh giá kết quả 32
2.3. Tiến hành nghiên cứu và các quy trình được thực hiện trong nghiên cứu . 34
2.3.1. Thu thập mẫu bệnh phẩm nghiên cứu 34
2.3.2. Phân lập tế bào từ mô u và dịch cổ trướng của bệnh nhân 35
2.3.3. Gây mô hình ung thư buồng trứng thực nghiệm 38
2.3.4. Đánh giá hiệu quả điều trị ung thư buồng trứng trên mô hình thực
nghiệm 43
2.3.5. Thực hiện quy trình kỹ thuật tế bào học, mô bệnh học và hoá mô
miễn dịch 44
2.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 51
2.5. Phương pháp phân tích kết quả và xử lý số liệu 52
2.6. Đạo đức nghiên cứu 53
2.7. Sơ đồ nghiên cứu 53
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 51
3.1. Kết quả gây ung thư buồng trứng thực nghiệm 51
3.1.1. Đặc điểm mô bệnh học và HMMD ung thư biểu mô buồng trứng 51
3.1.2. Kết quả phân lập tế bào từ 50 bệnh nhân UTBM buồng trứng 57
3.1.3. Kết quả phân lập dòng tế bào M4 từ khối u của bệnh nhân UTBM
buồng trứng 63
3.1.4. Kết quả gây ung thư buồng trứng thực nghiệm trên chuột nude
bằng cấy ghép dòng tế bào OVCAR-3 và M4 68
3.2. Kết quả tác động của virus vaccin sởi trên mô hình ung thư buồng trứng
thực nghiệm 82
3.2.1. Tác động của virus vaccin sởi lên tình trạng toàn thân và các cơ
quan gan, thận của chuột nude ở 4 nhóm nghiên cứu 82
3.2.2. Tác động của virus vaccin sởi lên tình trạng tại chỗ khối u thứ phát
ở 4 nhóm nghiên cứu 86
Chương 4: BÀN LUẬN 90
4.1. Kết quả gây thư buồng trứng thực nghiệm 90
4.1.1. Đặc điểm mô bệnh học và HMMD ung thư biểu mô buồng trứng 90
4.1.2. Phân lập tế bào từ 50 bệnh nhân UTBM buồng trứng 95
4.1.3. Phân lập tế bào dòng M4 từ khối u của bệnh nhân UTBM thanh
dịch độ cao 101
4.1.4. Kết quả tạo khối ung thư buồng trứng trên chuột nude 108
4.2. Tác động của virus vaccin sởi trên mô hình ung thư buồng trứng thực
nghiệm 121
4.2.1. Tác động của virus vaccin sởi lên tình trạng toàn thân và các cơ
quan gan, thận của chuột nude ở 4 nhóm nghiên cứu 121
4.2.2. Tác động của virus vaccin sởi lên tình trạng tại chỗ khối u của
chuột nude ở 4 nhóm nghiên cứu 123
KẾT LUẬN 130
KIẾN NGHỊ 132
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ LIÊNQUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Bảng 1.1. Kiểu hình miễn dịch của các typ ung thư biểu mô buồng trứng 9
Bảng 1.2. Các dấu ấn dùng để phân biệt ung thư buồng trứng nguyên phát với di căn UTBM tuyến đường tiêu hoá thấp 9
Bảng 1.3. Các dòng tế bào ung thư buồng trứng 15
Bảng 1.4. Các thử nghiệm điều trị ung thư bằng virus vaccin sởi trên mô hình
động vật tạo khối ung thư người tại Việt Nam 29
Bảng 3.1. Đặc điểm đại thể khối u 51
Bảng 3.2. Đặc điểm vi thể UTBM buồng trứng 53
Bảng 3.3. Biểu lộ các dấu ấn miễn dịch của UTBM buồng trứng 55
Bảng 3.4. Tỷ lệ tế bào sơ cấp bám đáy theo thời gian 57
Bảng 3.5. Hình thái tế bào sơ cấp trong môi trường nuôi cấy 58
Bảng 3.6. Đếm số lượng tế bào sơ cấp và tỷ lệ tế bào sống chết 58
Bảng 3.7. Kết quả biểu hiện thụ thể CD46 của tế bào sơ cấp được phân lập. 59
Bảng 3.8. Kết quả phát triển của tế bào sơ cấp trong môi trường nuôi cấy…. 60
Bảng 3.9. Đặc điểm của các mẫu tế bào sơ cấp phát triển tốt 61
Bảng 3.10. Tỷ lệ chuột xuất hiện u của nhóm OVCAR-3 và M4 69
Bảng 3.11. Đặc điểm vi thể khối u thứ phát sau cấy ghép dòng tế bào M4 trên chuột nude 72
Bảng 3.12. So sánh đặc điểm hình thái tế bào và kiểu hình miễn dịch khối u nguyên phát, dòng tế bào M4 và khối u thứ phát 75
Bảng 3.13. Tỷ lệ tế bào biểu lộ thụ thể CD46 trên bề mặt tế bào u ở khối u nguyên phát, dòng tế bào M4 và tế bào u thứ phát trên chuột nude 76
Bảng 3.14. Kết quả chỉ số công thức máu ở 4 nhóm nghiên cứu 83
Bảng 3.15. Kết quả chỉ số sinh hoá máu của 4 nhóm nghiên cứu 84
Bảng 3.16. Kết quả mô bệnh học gan, thận của 4 nhóm 84
Bảng 3.17. Các đặc điểm trên vi thể khối u thứ phát của 4 nhóm 87
DANH MỤC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Tốc độ tăng sinh của dòng tế bào M4 theo thời gian 66
Biểu đồ 3.2. Trọng lượng khối u cấy ghép dòng M4 và OVCAR-3 trên
chuột nude 69
Biểu đồ 3.3. Thể tích khối u cấy ghép dòng M4 và OVCAR-3 trên chuột nude . 70Biểu đồ 3.4. Trọng lượng chuột nude cấy ghép dòng M4 và OVCAR-3 nhóm
chứng và nhóm điều trị bằng virus vaccin sởi 82
Biểu đồ 3.5. Thể tích khối u cấy ghép dòng M4 và OVCAR-3 trên chuột nude
nhóm chứng và nhóm điều trị bằng virus vaccin sởi 86
Hình 1.1. Cơ chế bệnh sinh của ung thư buồng trứng 6
Hình 1.2. Các giai đoạn phát triển của tế bào được nuôi cấy 12
Ảnh 2.1. Cấy ghép dòng tế bào UTBT dưới da sườn lưng chuột nude 40
Ảnh 3.1. Đại thể của ung thư biểu mô buồng trứng 52
Ảnh 3.2. Vi thể các typ mô bệnh học UTBM buồng trứng 54
Ảnh 3.3. Nhuộm HMMD ung thư biểu mô buồng trứng typ thanh dịch độ cao … 56
Ảnh 3.4. Nhuộm HMMD x 200 với dấu ấn p53 của UTBM buồng trứng 57
Ảnh 3.5. Kết quả tế bào được sơ cấp phân lập từ bệnh nhân trên máy đếm tế
bào sống chết 59
Ảnh 3.6. Tỷ lệ tế bào sơ cấp bám đáy theo thời gian trên kính hiển vi ánh sáng
ngược x 200 62
Ảnh 3.7. Hình thái tế bào sơ cấp phân lập từ bệnh nhân trên kính hiển vi ánh
sáng ngược x 200 62
Ảnh 3.8. Các nguyên nhân gây chết tế bào trong quá trình phân lập trên kính
hiển vi ánh sáng ngược x 200 63
Ảnh 3.9. Ảnh đại thể và vi thể của khối u nguyên phát của bệnh nhân UTBM
buồng trứng typ thanh dịch độ cao, mã M4 64
Ảnh 3.10. Sự tăng sinh dòng tế bào M4 phân lập từ bệnh nhân theo thời gian
(ngày – N) trên kính hiển vi ánh sáng ngược x 200 66
Ảnh 3.11. Đặc điểm hình thái và kiểu hình miễn dịch của dòng tế bào M4 .. 68
Ảnh 3.12. Tạo mô hình ung thư buồng trứng người trên chuột nude bằng cấy
ghép dòng tế bào OVCAR-3 71
Ảnh 3.13. Tạo mô hình ung thư buồng trứng người trên chuột nude bằng cấy
ghép dòng tế bào M4 71
Ảnh 3.14. Xuất huyết mô u khi quan sát tại chỗ 72
Ảnh 3.15. Đặc điểm mô bệnh học và hóa mô miễn dịch của khối u thứ phát 74 Ảnh 3.16. Kết quả biểu lộ thụ thể CD46 bằng đếm tế bào dòng chảy 77
Ảnh 3.16. Siêu cấu trúc của tế bào u thứ phát cấy ghép dòng tế bào M4 78
Ảnh 3.17. Sự tăng sinh và hình thái tế bào phân lập từ khối u thứ phát theo thời
gian (ngày – N) trên kính hiển vi ánh sáng ngược x 200 79
Ảnh 3.18. Bộ nhiễm sắc thể của tế bào dòng M4 phân lập từ khối ung thư buồng
trứng typ thanh dịch độ cao của bệnh nhân 80
Ảnh 3.19. Bộ nhiễm sắc thể của tế bào phân lập từ khối u thứ phát cấy ghép
dòng M4 trên chuột nude 81
Ảnh 3.20. Vi thể mô gan và thận 85
Ảnh 3.21. Vi thể khối u thứ phát cấy ghép dòng OVCAR-3 và M4 88
Ảnh 3.22. Siêu cấu trúc của tế bào u thứ phát cấy ghép dòng M4 khi điều trị
bằng virus vaccin sởi 89
Nguồn: https://luanvanyhoc.com