Nghiên cứu phát triển vắc xin viêm gan A bất hoạt trên dòng tế bào MRC5 ở quy mô phòng thí nghiệm

Luận án Nghiên cứu phát triển vắc xin viêm gan A bất hoạt trên dòng tế bào MRC5 ở quy mô phòng thí nghiệm. Viêm gan A (VGA) là bệnh truyền nhiễm do vi rút viêm gan A gây nên. Bệnh phổbiến với 1,5 triệu người mắc mới hàng năm trên toàn thếgiới và có thể dự phòng được bằng vắc xin [33], [51], [72], [94]. Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng lưu hành cao của vi rút viêm gan A nên nhu cầu sử dụng  vắc xin viêm gan A là rất lớn [5], [9]. Nhằm thực hiện chiến lược dự phòng viêm gan A, Việt Nam đã sản xuất thành công vắc xin viêm gan A bất hoạt từnuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát Maccaca mulatta. Vắc xin này đã phát huy được tính hiệu quả, an toàn, đáp ứng được phần lớn nhu cầu vắc xin viêm gan A trong nước [18], [24], [25]. Tuy nhiên, công nghệsản xuất vắc xin này còn một sốhạn chếvì tếbào thận khỉ Maccaca mulatta phải chọn lọc qua việc kiểm soát chặt chẽcác vi rút ngoại lai, khó mởrộng vềquy mô sản xuất. Xu hướng hiện nay trên thếgiới là sửdụng vắc xin viêm gan A bất hoạt sản xuất trên tế bào lưỡng bội phổi người (MRC5 – Medical Research Council). Sửdụng dòng tếbào này đểsản xuất vắc xin có ưu điểm :

– Tế bào MRC5 có nguồn gốc từngười nên sửdụng dòng tếbào này đểsản xuất vắc xin sẽhạn chế được nguy cơdị ứng cho người.
– Sửdụng tếbào MRC5 đểsản xuất vắc xin thì có thểchủ động và dễmởrộng quy mô sản xuất.
– Dòng tếbào này đã được kiểm tra chất lượng và cấp phép sản xuất nhiều loại vắc xin trên thếgiới với chất lượng tốt.
– Sửdụng dòng tếbào MRC5 đểsản xuất vắc xin thay thếcho quy trình sản xuất vắc xin từtếbào thận khỉsẽtránh phải sửdụng động vật là nguyênliệu đầu vào cho sản xuất.
Hiện nay, chỉcó một sốhãng dược phNm lớn nhưGlaxo Smith Kline, Merck Sharp & Dohme, Aventis Pasteur sản xuất thành công vắc xin VGA trên tế bào lưỡng bội, nhưng giá thành rất cao. Hơn nữa, việc chuyển giao công nghệsản xuất các loại vắc xin nói chung và vắc xin VGA nói riêng vào Việt Nam
còn khó khăn. Để tiến tới tựlực sản xuất vắc xin viêm gan A trên tếbào MRC5 ởViệt Nam nhằm đáp ứng được nhu cầu vắc xin phòng bệnh cho cộng đồng cảvềsốlượng, chất lượng và giá thành, đề tài: “Nghiên cứu phát triển vắc xin viêm gan A bất hoạt trên dòng tế bào MRC5 ở quy mô phòng thí nghiệm” được tiến hành với 3 mục tiêu:
1. Thích ứng chủng vi rút viêm gan A HM 175 trên tếbào MRC5 đểsản xuất vắc xin viêm gan A.
2. Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất hoạt trên nuôi cấy tếbào MRC5 quy mô phòng thí nghiệm.
3. Đánh giá chất lượng vắc xin viêm gan A trong quá trình sản xuất và vắc xin thành phmMỤC LỤC
Trang
Trang phụbìa
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Các chữviết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
Danh mục các biểu đồ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Những hiểu biết hiện nay vềvi rút viêm gan A 3
1.1.1. Đặc điểm sinh học của vi rút viêm gan A 3
1.1.2. Đặc điểm sinh bệnh học, dịch tễviêm gan vi rút A 10
1.1.3. Các biện pháp dựphòng 12
1.2. Các loại vắc xin viêm gan A và quy trình sản xuất 15
1.2.1. Các loại vắc xin viêm gan A 15
1.2.2. Tình hình sản xuất vắc xin viêm gan A ởViệt Nam 19
1.2.3. Quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất hoạt trên nuôi cấy tế
bào MRC5 20
1.3. Các phơng pháp kiểm tra chất lợng vắc xin viêm gan A 24
1.3.1. Kiểm tra nguồn nguyên liệu sửdụng cho sản xuất vắc xin 24
1.3.2. Kiểm tra chất lượng vắc xin viêm gan A trong quá trình sản
xuất 28
1.3.3. Kiểm tra chất lượng vắc xin thành phNm 29
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
2.1. Vật liệu 33
2.1.1. Chủng vi rút 33
2.1.2. Các dòng tếbào 33
2.1.3. Vắc xin viêm gan A mẫu chuNn Quốc gia 34
2.1.4. Động vật thí nghiệm 34
2.1.5. Môi trường, hóa chất, sinh phNm 34
2.1.6. Dụng cụ, trang thiết bị 35
2.2. Phơng pháp nghiên cứu 36
2.2.1. Thích ứng vi rút viêm gan A HM175 trên tế bào MRC5 37
2.2.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A
bất hoạt trên nuôi cấy tếbào MRC5 quy mô phòng thí nghiệm 44
2.2.3. Phương pháp kiểm tra chất lượng vắc xin viêm gan A trên nuôi
cấy tếbào MRC5 trong quá trình sản xuất và vắc xin thành phNm 48
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢNGHIÊN CỨU 57
3.1. Kế t quả thích ứng vi rút viêm gan A HM175 trên tếbào MRC5 57
3.1.1. Tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy cho HAV HM175 trên tếbào
MRC5 trong môi trường có huyết thanh 57
3.1.2. Kết quảcấy truyền thích ứng 60
3.1.3. Kết quảsản xuất chủng giống và kiểm tra chất lượng chủng 60
3.2. Kết quảxây dựng quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất
hoạt trên nuôi cấy tếbào MRC5 quy mô phòng thí nghiệm 67
3.2.1. Kết quảnuôi cấy và chuNn bịtếbào MRC5 67
3.2.2. Kết quảgây nhiễm, nuôi cấy và thu hoạch vi rút 68
3.3. Kết quảsản xuất thửnghiệm và kiểm tra chất lợng trong quá
……..trình sản xuất và vắc xin thành ph)m 73
3.3.1. Kết quảkiểm tra trong quá trình sản xuất 73
3.3.2. Kết quảkiểm tra chất lượng vắc xin thành phNm 77
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 82
4.1. Thích ứng chủng
4.1.1. Ưu điểm của tếbào MRC5 trong sản xuất vắc xin
83
83
4.1.2. Nguồn gốc và chất lượng tếbào MRC5 sửdụng đểthích ứng
chủng và sản xuất vắc xin. 85
4.1.3. Chủng vi rút viêm gan A 86
4.1.4. Kỹ thuật lựa chọn đểthích ứng chủng 86
4.1.5. Lựa chọn các điều kiện nuôi cấy tối ưu 88
4.1.6. Chất lượng chủng giống vi rút viêm gan A cho sản xuất v ắc xin 89
4.2. Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A trên MRC5 91
4.2.1. Quy trình nuôi cấy tếbào 92
4.2.2. Gây nhiễm vi rút 93
4.2.3. Quy trình nuôi cấy và thu hoạch vi rút 95
4.2.4. Tinh sạch hỗn dịch vi rút
4.2.5. Bất hoạt vi rút
96
98
4.3. Chất lợng vắc xin viêm gan A sản xuất thửnghiệm
4.4. Ưu điểm, hạn chếvà tính mới của nghiên cứu
4.4.1. Ưu điểm
4.4.2. Hạn chế
4.4.3. Tính mới của nghiên cứu

108
KẾT LUẬN 109
KIẾN NGHN 111
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐKẾT QUẢ
NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀTÀI LUẬN ÁN
112
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤLỤC
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐKẾT QUẢNGHIÊN CỨU
CỦA ĐỀTÀI LUẬN ÁN
1. Nguyễn Thị Vân Quỳnh, ĐỗThủy Ngân, Nguyễn Thu Vân, ĐỗTuấn Đạt(2013) “ Tính an toàn và sinh mi ễn dị ch của v ắc xin viêm gan A sả n xuất trên nuôi cấy tếbào MRC5 tại Công ty V ắc xin và Sinh phNm số1” , tạp chí Y học Việt Nam, 408(1), tr.108-110.
2. Nguyễn ThịVân Quỳnh (2014) “ Xác định nhiệt độnuôi cấy tối ưu của chủng vi rút viêm gan A HM175 trên nuôi c ấy tếbào MRC5”, t ạp chí Y học Vi ệt Nam, 414(2), tr.28-30.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Đình Bảng, Hoàng Ngọc Hiển và CS(1992), Các Virut viêm gan, Vi sinh vật Y học, NXB Đại học và giáo dục chuyên nghiệp, Hà Nội, tr. 285-297.
2. Nguyễn Đình Bảng, Nguyễn ThịKim Hơng(2003), Vacxin và chế phẩm miễn dịch trong phòng và điều trị, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội,
tr.173-181.
3. Bộ Y tế(2009), Dược thư quốc gia Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr.250-253, 316-350.
4. Nguyễn ThịChính, Trơng ThịHòa(2005), Virut viêm gan A, Vi sinh vật Y học, NXB Đại học quốc gia Hà Nội, Hà Nội, tr. 213-214.
5. Đinh Hồng Dơng(2007), Đặc điểm nhiễm vi rút viêm gan A ởmột số đối tượng và tính an toàn, tính sinh miễn dịch của vắc xin phòng viêm gan A do Việt Nam sản xuất, Luận án tiến sĩY học, Học viện Quân Y.
6. ĐỗTuấn Đạt, Nguyễn Thu Vân và CS.(2010), Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệsản xuất vắc xin dại trên nuôi cấy tếbào Vero ở quy mô phòng thí nghiệm, Chương trình KH & CN trọng điểm cấp nhà nước KC.10/06-10. Nghiệm thu năm 2010.
7. Hoàng Ngọc Hiển(1996), “Virut gây bệnh viêm gan”, Giám sát chủ động phòng chống một sốbệnh truyền nhiễm gây dịch, Học viện Quân
Y/BộQuốc phòng; VụVệsinh phòng dịch/BộY tế. Hà Nội, tr. 38-50.
8. Hoàng Ngọc Hiển(2001), Vacxin – Huyết thanh miễn dịch, Học viện Quân Y, Hà Nội.
9. Lê Văn Hiệp(2006), “Vacxin viêm gan A”, Vắc xin học những vấn đề cơbản, NXB Y học, Hà Nội, tr. 232-234.
10. Hội đồng Dợc điển Việt Nam(2009), “Phụlục 15.7. Xác định tính vô khuNn cho vắc – xin và sinh phNm “, Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội, tr. 320-321.
11. Hội đồng Dợc điển Việt Nam(2009), “Phụlục 15.11. Thửnghiệm an toàn chung cho vắc – xin và sinh phNm”, Dược điển Việt Nam IV, NXB
Y học, Hà Nội, tr. 320-321.
12. Hội đồng Dợc điển Việt Nam(2009), “Phụlục 15.12. Xác định chất gây sốt trong vắc – xin và sinh phNm”, Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội, tr. 324.
13. Hội đồng Dợc điển Việt Nam(2009), “Phụlục 15.25. Xác định hàm lượng formaldehyde tồn dưtrong vắc – xin và sinh phNm”, Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội,tr. 339-340.
14. Hội đồng Dợc điển Việt Nam(2009), “Phụlục 15.27. Xác định hàm lượng nhôm Al +++ trong vắc – xin và sinh phNm”, Dược điển Việt Nam IV,, NXB Y học, Hà Nội, tr. 345-346.
15. Hội đồng Dợc điển Việt Nam(2009), “Phụlục 15.34. Xác định hàm lượng protein toàn phần trong vắc – xin và sinh phNm “, Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội, tr. 346-347.
16. Hội đồng Dợc điển Việt Nam (2009), “Phụ lục 15.36. Phát hiện Mycoplasma bằng phương pháp nuôi cấy”, Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội, tr. 348.
17. Lê Hoàng Long(2005), Nghiên cứu điều kiện tối ưu trong pha chếvắc xin viêm gan A. , Luận văn thạc sĩkhoa học. Trường Đại học Khoa học tựnhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.
18. VũHồng Nga(2004), Nghiên cứu sựthích ứng của virut viêm gan A chủng HM-175 trên tếbào thận khỉMaccaca Mulatta tiên phát dùng
trong sản xuất vacxin viêm gan A, Luận văn thạc sĩkhoa học Sinh học, Đại học khoa học tựnhiên, Đại học quốc gia Hà Nội.
19. Nguyễn Thái Sơn, Lê Thu Hồng, Kiều Chí Thành, Nguyễn Văn Việt và cs (2011), “Virus gây bệnh viêm gan”, Vi sinh Y học, NXB Quân đội nhân dân, Hà Nội, tr. 303-312.
20. Trung tâm kiểm định Quốc gia sinh ph)m Y học(2001), Hướng dẫn thực hành sản xuất đúng (GMP) cho vacxin, sinh ph!m Việt Nam, Hà Nội, tr. 23-24.
21. Phạm Văn Ty (2005), “Virut Picorna, Họ Picornaviridae”, Virut học, NXB Giáo dục, Hà Nội, tr. 256-263.
22. Nguyễn Thu Vân(2002), “Virut viêm gan A”, Dịch tễhọc và dựphòng các bệnh viêm gan virut từA đến E, NXB Y học, Hà Nội, tr. 15- 39.
23. Nguyễn Thu Vân, Hoàng Thủy Nguyên và cộng sự(1999), “Nghiên cứu tinh khiết vi rút viêm gan A HM175 từnuôi tếbào thận khỉtiên phát Muccaca mulatta đểsản xuất vắc xin viêm gan A”, Tạp chí Y học dựphòng, tập IX, số4 (42).
24. Nguyễn Thu Vân và cộng sự (2002), Nghiên cứu tiếp thu chuyển nhượng kỹthuật đểxây dựng qui trình công nghệsản xuất vắcxin viêm gan A và vắcxin viêm gan B tái tổhợp ADN, Đềtài nghiên cứu khoa học công nghệnhà nước, mã sốKH-11-10B, Nghiệm thu năm 2002.
25. Nguyễn Thu Vân và cộng sự(2005), Hoàn thiện quy trình công nghệsản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt qui mô 100.000 liều/năm, Dựán sản xuất thửnghiệm cấp nhà nước, mã sốKC.10-DA12, Nghiệm thu năm 2005