Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư phổi của virus vaccine Sởi trên thực nghiệm

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư phổi của virus vaccine Sởi trên thực nghiệm.Ung thư phổi (UTP) là loại ung thư phổ biến đứng thứ 2 trên toàn thế giới, sau ung thư vú. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm 2020 có khoảng 2,21 triệu ca UTP mới và 1,8 triệu ca tử vong do UTP trên thế giới.1 UTP là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong do ung thư ở cả nam và nữ. Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong sàng lọc, phân loại, chẩn đoán, tiên lượng nhưng UTP vẫn là một thách thức đối với các nhà lâm sàng. Điều trị UTP hiện nay là điều trị đa phương thức bao gồm: phẫu thuật, xạ trị và/hoặc điều trị hệ thống (hóa chất, điều trị hormon, liệu pháp điều trị đích). Bệnh thường được phát hiện ở giai đoạn muộn, khối u lớn và di căn, tỷ lệ sống trên 5 năm thay đổi tùy giai đoạn của bệnh và loại mô bệnh học, tuy nhiên số lượng ước tính dưới 18% cho tất cả các giai đoạn của bệnh. Hơn 50% trường hợp tử vong trong vòng 1 năm sau khi được chẩn đoán UTP.1

Trị liệu ung thư bằng virus ly giải tế bào u (Oncolytic virus-OV) đã có lịch sử gần 100 năm. Tuy nhiên, liệu pháp OV được mở ra bắt đầu từ những năm đầu thập kỷ 90 của thế kỷ 20. Nhiều thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I-III, đã chứng minh liệu pháp OV dung nạp tốt, có nhiều hứa hẹn. Talimogene laherparepvec là OV đầu tiên được FDA đã phê duyệt cho điều trị u hắc tố trên lâm sàng năm 2015.2 Liệu pháp OV có nhiều ưu thế hơn các liệu pháp cổ điển như: ít tác dụng phụ, có khả năng tự tăng cường các hoạt động kháng u thông qua quá trình xâm nhập đặc hiệu vào tế bào ung thư, virus tự sao chép nhân lên và ly giải tế bào ung thư. Quá trình ly giải tế bào ung thư của virus trong liệu pháp OV, dẫn tới hai hiệu ứng: một là, các virus vừa được giải phóng từ quá trình ly giải tế bào tiếp tục lây nhiễm lan rộng ra các tế bào u lân cận; mặt khác các sản phẩm protein, mãnh vở tế bào ung thư có tác dụng kích thích miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu chống lại mô ung thư, làm tăng cường hiệu quả kháng u. Chính vì vậy, liệu pháp OV có khả năng áp dụng2 rộng rãi cho nhiều loại ung thư. Đến nay, nhiều OV được biến đổi bộ gen nhằm tăng khả năng lây nhiễm và ly giải tế bào ung thư đặc hiệu.
Trong các chủng OV, virus vaccine sởi sống, giảm độc lực (Liveattenuated measles virus: MeV) sử dụng trong điều trị một số ung thư người đã được chứng minh có hiệu quả. Nhiều thử nghiệm lâm sàng sử dụng MeV bằng các con đường khác nhau: tiêm nội u, tiêm tĩnh mạch, tiêm phúc mạc, tiêm màng phổi… điều trị các loại ung thư như: u lympho tế bào T ở da, ung thư đại trực tràng, ung thư buồng trứng, u nguyên bào đệm đa dạng, UTP… với kết quả nhiều hứa hẹn.
Ở Việt Nam, sử dụng MeV điều trị ung thư là liệu pháp có tiềm năng đang được quan tâm nghiên cứu. Nước ta đã làm chủ được công nghệ tiên tiến sản xuất vaccine sởi, tiêm chủng an toàn trên người. Gần đây, Học viện Quân y đã nghiên cứu tác dụng của virus vaccine sởi dùng đơn và phối hợp điều trị trên 10 dòng ung thư máu người khác nhau và các dòng tế bào tạo khối u rắn cho thấy, MeV có tác dụng kháng ung thư rõ rệt. Đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào đi sâu đánh giá hiệu quả MeV kháng UTP người trên thực nghiệm. Nghiên cứu hiệu quả MeV kháng UTP người sẽ mở đầu cho việc đi sâu nghiên cứu, áp dụng một phương pháp mới điều trị UTP trên lâm sàng.
Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài: ”Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư phổi của virus vaccine Sởi trên thực nghiệm” với hai mục tiêu sau:
1. Đánh tác dụng của virus vaccine Sởi trên tế bào ung thư phổi người (A549 và H460) in vitro.
2. Đánh giá hiệu quả kháng ung thư của virus vaccine Sởi trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư phổi người dòng tế bào H460

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………………………………….1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………………….3
1.1. Ung thư phổi …………………………………………………………………………………..3
1.1.1. Tình hình ung thư phổi trên thế giới…………………………………………….3
1.1.2. Tình hình ung thư phổi ở Việt Nam …………………………………………….4
1.1.3. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ ung thư phổi …………………………5
1.1.4. Phân loại ung thư phổi……………………………………………………………….9
1.1.5. Cơ chế bệnh sinh của ung thư phổi…………………………………………….10
1.1.6. Các phương pháp điều trị ung thư phổi hiện nay tại Việt Nam………17
1.2. Liệu pháp virus vaccine sởi điều trị ung thư phổi người ……………………..21
1.2.1. Sinh học virus sởi ……………………………………………………………………21
1.2.2. Virus vaccine sởi lây nhiễm đặc hiệu tế bào ung thư phổi…………….22
1.2.3. Các cơ chế virus vaccine sởi ly giải tế bào ung thư phổi ………………24
1.2.4. Đáp ứng miễn dịch vật chủ kháng MeV……………………………………..34
1.2.5. Các thử nghiệm lâm sàng sử dụng MeV điều trị ung thư………………35
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………..37
2.1. Đối tượng nghiên cứu …………………………………………………………………….37
2.1.1. Động vật…………………………………………………………………………………37
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu………………………………………………………………….37
2.1.3. Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu …………………………………….38
2.2. Phương pháp nghiên cứu ………………………………………………………………..39
2.2.1. Nuôi cấy và tăng sinh các dòng tế bào ……………………………………….39
2.2.2. Tăng sinh và chuẩn độ virus vaccine sởi …………………………………….41
2.2.3. Đánh giá virus vaccine sởi ly giải tế bào bằng thử nghiệm MTT………45
2.2.4. Chuẩn bị mẫu tế bào H460 và A549 nhiễm MeV đánh giá tế bào
chết theo chương trình bằng phương pháp dòng chảy ……………………47
2.2.5. Phương pháp phân tích tế bào dòng chảy đánh giá tỉ lệ tế bào H460
và A549 chết theo chương trình ………………………………………………….50
2.2.6. Phương pháp nuôi chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) …………..52
2.2.7. Tạo khối u tế bào H460 trên đùi chuột nude và tính thể tích khối u …..53
2.2.8. Phương pháp điều trị chuột nude bằng MeV……………………………….54
2.2.9. Phương pháp đánh giá hiệu quả điều trị khối u tế bào H460 của MeV…..54
2.2.10. Phương pháp phẫu tích lấy mô u tế bào H460 ở chuột nude sau
điều trị bằng MeV……………………………………………………………………..55
2.2.11. Xử lý mô u tế bào H460 thành mẫu tế bào để đánh giá tỉ lệ các tế
bào miễn dịch và tế bào chết theo chương trình bằng phương pháp
tế bào dòng chảy……………………………………………………………………….56
2.2.12. Đánh giá siêu cấu trúc mô u tế bào H460 trên chuột nude sau điều
trị bằng MeV ……………………………………………………………………………58
2.2.13. Phân tích giải phẫu bệnh mô u tế bào H460 cấy ghép trên chuột nude …..59
2.2.14. Phương pháp phân tích kết quả………………………………………………..61
2.2.15. Đạo đức trong nghiên cứu ………………………………………………………61
2.2.16. Hạn chế của nghiên cứu………………………………………………………….62
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………………………………………65
3.1. Nuôi cấy, tăng sinh dòng tế bào H460 A549, Vero và virus vaccine sởi ………..65
3.1.1. Nuôi cấy, tăng sinh các dòng tế bào H460, A549 và Vero ……………65
3.1.2. Tăng sinh virus vaccine sởi ………………………………………………………66
3.2. Chuẩn độ TCID50 của virus vaccine sởi…………………………………………….67
3.3. Ly giải trực tiếp tế bào ung thư phổi người dòng H460 và A549 của
Virus vaccine sởi in vitro ………………………………………………………………………68
3.3.1. Tế bào H460 và A549 nhiễm virus vaccine sởi tạo hợp bào in vitro ……68
3.3.2. Hiệu quả ly giải tế bào ung thư phổi người H460 và A549 bằng
thử nghiệm MTT của virus vaccine sởi………………………………………..69
3.3.3. Đánh giá tỉ lệ tế bào H460 và A549 chết theo chương trình sau nhiễm
MeV in vitro bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy………………75
3.4. Virus vaccine sởi kháng u tế bào ung thư phổi H460 cấy ghép trên
chuột thiếu hụt miễn dịch………………………………………………………………………87
3.4.1. Kết quả ghép u dòng tế bào ung thư phổi người H460 …………………87
3.4.2. Kết quả điều trị chuột nude mang khối u tế bào ung thư phổi người
H460 bằng virus vaccine sởi ………………………………………………………88
3.4.3. Tỉ lệ tế bào u H460 cấy ghép trên chuột nude chết theo chương
trình sau điều trị bằng MeV………………………………………………………..91
3.4.4. Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u phổi H460 và A549 sau điều trị
bằng virus vaccine sởi ……………………………………………………………….94
3.4.5. Kết quả giải phẫu bệnh u tế bào H460 cấy ghép trên chuột Nude
sau điều trị bằng MeV ……………………………………………………………….96
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ………………………………………………………………………97
4.1. Tăng sinh các dòng tế bào Vero và tế bào ung thư phổi người H460 và
A549 in vitro ……………………………………………………………………………………….97
4.1.1. Tăng sinh dòng tế bào Vero………………………………………………………97
4.1.2. Nuôi cấy, tăng sinh dòng tế bào ung thư phổi người H460 và A549……..98
4.2. Tăng sinh virus vaccine sởi và Chuẩn độ TCID50 ………………………………99
4.3. Virus vaccine sởi ly giải tế bào H460 và A540 in vitro …………………….102
4.3.1. Ly giải trực tiếp bằng cách tạo hợp bào in vitro…………………………102
4.3.2. Đánh giá hiệu quả của virus vaccine sởi ly giải tế bào H460 và
A549 bằng nghiệm pháp MTT………………………………………………….104
4.3.3. MeV gây chết tế bào apoptosis dòng tế bào ung thư phổi H460 và
A549 invitro …………………………………………………………………………..105
4.4. Virus vaccine sởi kháng u tế bào ung thư phổi người H460 cấy ghép
trên chuột thiếu hụt miễn dịch ……………………………………………………………..108
4.4.1. Đánh giá độc tính của virus vaccine sởi điều trị chuột thiếu hụt
miễn dịch mang khối u tế bào ung thư phổi người H460………………108
4.4.2. Virus vaccine sởi kháng u tế bào ung thư phổi người H460 trên
chuột thiếu hụt miễn dịch …………………………………………………………109
4.4.3. Virus vaccine sởi kích thích miễn dịch đặc hiệu kháng u tế bào ung
thư phổi người H460 trên chuột thiếu hụt miễn dịch……………………112
4.4.4. MeV kháng tế bào u H460 cấy ghép trên chuột nude qua con
đường chết tế bào apoptosis ……………………………………………………..117
4.4.5. Kết quả siêu cấu trúc tế bào u phổi người H460 ghép trên chuột
thiếu hụt miễn dịch sau điều trị bằng virus vaccine sởi ………………..119
4.4.6. Kết quả giải phẫu bệnh tế bào u phổi người H460 ghép trên chuột
thiếu hụt miễn dịch sau điều trị bằng virus vaccine sởi ………………..123
KẾT LUẬN ………………………………………………………………………………………….128
KHUYẾN NGHỊ…………………………………………………………………………………..130
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
CỦA ĐỀ TÀI, LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ Tên biểu đồ Trang
Biểu đồ 3.1. Kết quả MTT của tế bào H460 nhiễm MeV ngày thứ 3……………69
Biểu đồ 3.2. Kết quả MTT của tế bào A549 nhiễm MeV ngày thứ 3……………70
Biểu đồ 3.3. Kết quả MTT ở ngày thứ 4 nhiễm MeV …………………………………71
Biểu đồ 3.4. Kết quả MTT ở ngày thứ 4 nhiễm MeV …………………………………72
Biểu đồ 3.5. So sánh tỷ lệ tế bào H460 sống theo các thời điểm nhiễm MeV..73
Biểu đồ 3.6. So sánh tỷ lệ tế bào A549 sống theo các thời điểm nhiễm MeV..74
Biểu đồ 3.7. Tỉ lệ tế bào H460 nhiễm MeV ngày thứ 3 chết theo chương trình …76
Biểu đồ 3.8. Tỉ lệ tế bào H460 nhiễm MeV ngày thứ 4 chết theo chương trình ….77
Biểu đồ 3.9. Tỉ lệ tế bào H460 nhiễm MeV ngày thứ 5 chết theo chương trình ….79
Biểu đồ 3.10. So sánh tế bào H460 chết theo chương trình theo ngày nhiễm MeV…80
Biểu đồ 3.11. Tỉ lệ tế bào A549 chết theo chương trình ở ngày thứ 3 nhiễm MeV …81
Biểu đồ 3.12. Tỉ lệ tế bào A549 chết theo chương trình ở ngày thứ 4 nhiễm MeV …83
Biểu đồ 3.13. Tỉ lệ tế bào A549 nhiễm MeV ngày thứ 5 chết theo chương trình …85
Biểu đồ 3.14. So sánh tế bào A549 chết theo chương trình theo ngày nhiễm MeV…86
Biểu đồ 3.15. Thay đổi trọng lượng chuột sau điều trị bằng MeV………………….88
Biểu đồ 3.16. Kết quả kích thước khối u sau điều trị bằng MeV……………………89
Biểu đồ 3.17. So sánh thời gian sống và tỉ lệ sống-chết của chuột sau điều trị
bằng MeV…………………………………………………………………………..90
Biểu đồ 3.18. Tỉ lệ tế bào u H460 chết theo chương trình sau điều trị MeV ……92
Biểu đồ 3.19. Kết quả tỉ lệ các tế bào miễn dịch ở mô u tế bào H460 trên chuột
nude sau điều trị bằng MeV……………………………………………………93DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình Tên hình Trang
Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc virus sởi……………………………………………………………21
Hình 1.2. MeV kích hoạt hệ miễn dịch kháng tế bào u……………………………….31
Hình 2.1. Các máy sử dụng cho nghiên cứu ……………………………………………..38
Hình 2.2. Hình ảnh buồng đếm Neubauer…………………………………………………41
Hình 2.3. Sơ đồ nhiễm MeV để chuẩn độ TCID50……………………………………..43
Hình 2.4. Pha loãng nồng độ MeV…………………………………………………………..44
Hình 2.5. Sơ đồ nhiễm MeV theo các nhóm đánh giá tỉ lệ tế bào chết theo
chương trình in vitro………………………………………………………………..48
Hình 2.6. Mẫu xác định thông số chuẩn máy trên phần mềm BD FACS Diva
đánh giá tỉ tế bào chết apoptosis và tế bào hoại tử……………………….52
Hình 2.7. Buồng và lồng nuôi chuột nude ………………………………………………..53
Hình 2.8. Ghép u tế bào H460…………………………………………………………………53
Hình 2.9. Xác định thông số chuẩn cho máy bằng phần mềm BD FACS Diva ….57
Hình 3.1. Tế bào ung thư phổi dòng H460 bám đáy và phát triển………………..65
Hình 3.2. Tế bào ung thư phổi dòng A549 bám đáy và phát triển………………..65
Hình 3.3. Tế bào Vero bám đáy và phát triển ……………………………………………65
Hình 3.4. Tế bào Vero nhiễm MeV………………………………………………………….66
Hình 3.5. Kết quả chuẩn độ TCID50 sử dụng thuốc nhuộm xanh methylen………67
Hình 3.6. Hình ảnh tế bào H460 và A549 nhiễm MeV tạo hợp bào in vitro ………68
Hình 3.7. Kết quả flow cytometry của tế bào H460 nhiễm MeV ngày thứ 3 ……..75
Hình 3.8. Kết quả flow cytometry của tế bào H460 nhiễm MeV ngày thứ 4 ……..77
Hình 3.9. Kết quả flow cytometry của tế bào H460 nhiễm MeV ngày thứ 5 ……..78
Hình 3.10. Kết quả flow cytometry của tế bào A549 nhiễm MeV ngày thứ 3 ……..81
Hình 3.11. Kết quả flow cytometry của tế bào A549 nhiễm MeV ngày thứ 4 ……..82
Hình 3.12. Kết quả flow cytometry tế bào A549 nhiễm MeV ngày thứ 5……….84
Hình 3.13. Kết quả ghép u tế bào H460 dưới da đùi chuột nude……………………87Hình 3.14. Kết quả flow cytometry tế bào u H460 chết theo chương trình……..91
Hình 3.15. Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u H460 không nhiễm virus …………….94
Hình 3.16. Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào H460 hoại tử sau tiêm MeV …………..94
Hình 3.17. Siêu cấu trúc MeV xâm nhập vào tế bào u phổi H460 …………………95
Hình 3.18. Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u H460 chết theo chương trình sau
tiêm MeV……………………………………………………………………………….95
Hình 3.19. Hình ảnh giải phẫu bệnh tế bào u phổi bình thường …………………….96
Hình 3.20. Hình ảnh giải phẫu bệnh tế bào u phổi hoại tử sau tiêm MeV……….9