NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY VIÊM PHỔI THỞ MÁY VÀ GENE KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY VIÊM PHỔI THỞ MÁY VÀ GENE KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ.Viêm phổi thở máy (VPTM) là một vấn đề lâm sàng quan trọng không chỉ ở Việt Nam mà còn trên thế giới vì tần suất mắc bệnh và tử vong tăng cao. Nghiên cứu (NC) ở các nước Âu – Mỹ cho thấy tỉ lệ VPTM là 10% [61], [105]. Tại Canada, VPTM là 18 ca trên 1000 ngày thở máy [75]. Các quốc gia Á Châu VPTM là 18% [43]. Tại Việt Nam, VPTM dao động từ 20% – 52%, [2], [5], [7], [8], [11], [16], [17]. VPTM là nguyên nhân hàng đầu gây tăng tỉ lệ tử vong (26% – 72%), kéo dài thời gian nằm viện (41 so với 23 ngày ở nhóm có và không VPTM) và tăng chi phí điều trị (5 – 10 lần) [5], [41].

VPTM được định nghĩa là viêm nhu mô phổi xảy ra sau 48 giờ thở máy qua nội khí quản hoặc qua khai khí quản [42], [61]. Chẩn đoán VPTM được thiết lập dựa trên chứng cứ lâm sàng và vi sinh. Việc xác định vi khuẩn (VK) gây bệnh thôngqua cấy định lượng hoặc bán định lượng đàm hút qua nội khí quản đơn thuần hoặc qua nội soi phế quản [34], [41], [50].
Việc định danh VK bằng nhuộm Gram, nuôi cấy, đặc tính mọc và các phảnứng sinh hóa là chuẩn mực. Tuy nhiên phương pháp vi sinh kinh điển này không thể áp dụng trong các trường hợp sau: VK Gram âm khó mọc, mọc chậm; VK hiếm hoặc chỉ biểu hiện một vài đặc tính về sinh hóa. Cũng như các VK yếm khí, VK không cấy được và bệnh lý nhiễm khuẩn có kết quả cấy âm tính, nhất là trên bệnh nhân (BN) sử dụng kháng sinh trước đó [50], [57], [73], [74], [83], [97], [114].
Chẩn đoán phân tử, ngày nay, đã trở thành phương pháp tham chiếu để chẩnđoán vi sinh học của nhiều bệnh lý hô hấp [73]. Vai trò của giải trình tự gene 16S -rRNA trong định danh VK càng được chứng tỏ và được áp dụng rộng rãi trên lâm sàng [57], [58], [80], [116], [117]. Phương pháp giải trình tự gene 16S – rRNA có thể phát hiện được hệ vi sinh trên đường hô hấp của người khỏe và BN [29], [44],[88]. Tại Việt Nam số liệu từ các NC về định danh VK dựa trên sinh học phân tử ở các BN VPTM chưa nhiều và chưa được hệ thống đầy đủ.2
Ngày nay, VK đa kháng kháng sinh là một thách thức toàn cầu [58]. Đặc biệtlà các quốc gia Á Châu, kể cả Việt Nam [12], [20], [59], [74], [78], [101]. Tỉ lệ A. baumannii kháng Carbapenem tăng lên nhanh chóng 6,7% (2001) [8]; 8% (2004)[17]; 80% (2010) [11]; 90% (2012) [5]. Tuy nhiên, kháng sinh đồ định lượng MIC bằng que E-test chưa được áp dụng rộng rãi và số liệu chưa được hệ thống đầy đủ.Các VK mang gene SHV, TEM, IMP, OXA, NDM thủy phân phổ rộng cáccephalosporin là thường gặp [81]. Trong nước, việc tiếp cận có hệ thống gene khángthuốc của VK chính yếu gây VPTM chưa được ghi nhận và hệ thống hóa đầy đủ.
Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào áp dụng giải trình tự thế hệ mới trong việc xác định VK gây VPTM trên các mẫu dịch rửa phế quản phế nang. Chúng tôiđặt ra 3 câu hỏi nghiên cứu: (a) Có sự khác biệt nào trong định danh VK gây VPTM giữa hai phương pháp định danh VK dựa vào kiểu hình và giải trình tự gene 16SrRNA; (b) Giá trị MIC và tỉ lệ đề kháng kháng sinh ở các nhóm VK gây VPTMphân bố như thế nào?; (c) Tỉ lệ VK chính yếu gây VPTM mang gene kháng thuốc là bao nhiêu và có mối liên quan giữa các VK mang gene kháng thuốc với MIC hay không? Trả lời những câu hỏi nghiên cứu trên sẽ cung cấp những kiến thức quan trọng về qui mô đề kháng kháng sinh và xác lập được những tác nhân liên quan đếnVPTM, giúp cho việc điều trị BN tốt hơn.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Mục tiêu:
1. Xác định đặc điểm vi khuẩn gây viêm phổi thở máy bằng kỹ thuật giảitrình tự gene 16S – rRNA, có so sánh với phương pháp định danh vi khuẩn dựa vào nhuộm Gram, nuôi cấy và các phản ứng sinh hóa.
2. Đánh giá MIC và tỉ lệ đề kháng kháng sinh ở các nhóm vi khuẩn gây viêmphổi thở máy.
3. Xác định gene kháng thuốc của vi khuẩn gây viêm phổi thở máy bằng kỹ thuật PCR và mối liên quan với MIC

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Bảng từ viết tắt và đối chiếu thuật ngữ Anh – Việt
Danh mục các bảng
Danh mục các biểu đồ, sơ đồ
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU …………………………………………………………… 3
1.1. Định nghĩa………………………………………………………………………3
1.2. Tỉ lệ mới mắc của viêm phổi thở máy ………………………………………………………. 5
1.3. Tỉ lệ tử vong ………………………………………………………………………………………….. 6
1.4. Bệnh nguyên………………………………………………………………………………………….. 8
1.5. Các yếu tố nguy cơ……………………………………………………………………………….. 25
1.6. Chẩn đoán……………………………………………………………………………………………. 28
1.7. Thực hiện kháng sinh đồ trên vi khuẩn phân lập được từ VPTM………………… 29
1.8. Ứng dụng sinh học phân tử trong phát hiện gene kháng thuốc……………………. 30
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………….. 32
2.1. Thiết kế nghiên cứu………………………………………………………………………………. 32
2.2. Địa điểm nghiên cứu …………………………………………………………………………….. 32
2.3. Thời gian nghiên cứu ……………………………………………………………………………. 32
2.4. Đối tượng nghiên cứu……………………………………………………………………………. 32
2.5. Cỡ mẫu và công thức tính cỡ mẫu ………………………………………………………….. 32
2.6. Tiêu chuẩn chọn mẫu ……………………………………………………………………………. 33
2.7. Phương pháp tiến hành………………………………………………………………………….. 34
2.8. Phương pháp phát hiện gene kháng thuốc…………………………………….45
2.9. Thu thập số liệu và phân tích dữ liệu ………………………………………………………. 45
2.10. Đạo đức trong nghiên cứu……………………………………………………46
2.11. Liệt kê và định nghĩa các biến số (phụ lục 11) ……………………………………….. 462.12. Sơ đồ nghiên cứu……………………………………………………………..47
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………………………….. 48
3.1. Đặc điểm chung……………………………………………………………………………………. 48
3.2. Định danh vi khuẩn dựa trên vi sinh kinh điển …………………………………………. 50
3.3. Định danh vi khuẩn dựa trên giải trình tự gene 16S-rRNA ………………………… 51
3.4. Tổng số loài vi khuẩn phát hiện được trên từng mẫu dịch rửa phế quản
phế nang ……………………………………………………………………………………………………. 55
3.5. So sánh giữa giải trình tự gene 16S-rRNA và vi sinh kinh điển trong định
danh vi khuẩn …………………………………………………………………………………………….. 56
3.6. Tính độ nhạy và độ đặc hiệu của PGM……………………………………………………. 58
3.7. Thời gian nằm ICU và tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thở máy ………………. 59
3.8. Kết quả kháng sinh đồ…………………………………………………………………………… 60
3.9. Kết quả kháng sinh đồ MIC dựa trên E-test……………………………………………… 66
3.10. Kết quả PCR tìm gene kháng thuốc ………………………………………………………. 73
3.11. Kết quả điều trị…………………………………………………………………………………… 75
Chương 4: BÀN LUẬN……………………………………………………………………………… 76
4.1. Định danh vi khuẩn ………………………………………………………………………………. 77
4.2. Kết quả kháng sinh đồ…………………………………………………………………………… 91
4.3. Xác định gene kháng thuốc và mối liên quan với đề kháng kháng sinh……….. 98
KẾT LUẬN …………………………………………………………………………………………….. 105
KIẾN NGHỊ……………………………………………………………………………………………. 108
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Tử suất thô theo điều trị kháng sinh ban đầu:…………………………….7
Bảng 1.2. Bệnh nguyên của viêm phổi thở máy:……………………………………8
Bảng 1.3. Tần suất vi khuẩn phân lập được từ ICU bệnh viện Fatmawati:………..11
Bảng 1.4. Tần suất vi khuẩn phân lập được từ các bệnh nhân viêm phổi tại các khoa
ICU ở Việt Nam:……………………………………………………………..12
Bảng 1.5.1. Tác nhân vi khuẩn phân lập được từ các bệnh nhân thở máy tại ICU
bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh:………………………….13
Bảng 1.5.2. Tác nhân vi khuẩn phân lập được từ các bệnh nhân thở máy tại ICU
bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh (tiếp theo):……………..14
Bảng 1.6. Tính đa dạng của vi khuẩn phát hiện được bằng giải trình tự gene:…….25
Bảng 1.7. Các yếu tố nguy cơ của VPTM:…………………………………………26
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng tạo các amplicon – phản ứng tạo “bản sao” các
vùng V3, V6, V7 và V9 trong gen 16S-rRNA:………………………………38
Bảng 2.2. Thành phần hóa chất thêm vào dung dịch rửa trong việc tinh sạch phản
ứng PCR khuếch đại các vùng V3, V6, V7 và V9 trong gene 16S-rRNA:…..39
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng tạo amplicon hoàn chỉnh – tạo “đầu bằng” cho các
bản sao của vùng V3, V6, V7 và V9 trong gene 16S-rRNA:…………………40
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng tạo “thư viện” – phản ứng gắn Adapter và trP1 vào
2 đầu các bản sao “đầu bằng” của vùng V3, V6, V7 và V9 trong gene 16SrRNA:…………………………………………………………………………40
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng tạo “bản sao” của các thư viện:………….………41
Bảng 2.6. Thành phần dung dịch sử dụng cho việc gắn “thư viện” gene vào hạt ISP:
………………………………………………………………………………………42
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng chuẩn bị gắn “thư viện” gene vào hạt ISP:………43
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng tách mạch “thư viện” gene khỏi bản sao đã gắn trên
hạt SP:….……………………………………………………………………..43
Bảng 3.1. Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân nghiên cứu:…………………………49Bảng 3.2. Phân bố vi khuẩn phân lập được bằng định danh truyền thống:………..51
Bảng 3.3. So sánh hai phương pháp định danh vi khuẩn dựa vào nuôi cấy và giải
trình tự trên hệ thống PGM:……………………………………………………….57
Bảng 3.4. Độ nhạy và độ đặc hiệu của PGM:……………………………………….58
Bảng 3.5. Kết quả kháng sinh đồ khuếch tán chung:………………………………60
Bảng 3.6. Kháng sinh đồ khuếch tán đối với Acinetobacter spp:………………….61
Bảng 3.7. Kháng sinh đồ khuếch tán đối với Klebsiella spp:…………………………….62
Bảng 3.8. Kháng sinh đồ khuếch tán đối với Pseudomonas spp:………………….63
Bảng 3.9. Kết quả kháng sinh đồ MIC đối với Acinetobacter baumannii:…………66
Bảng 3.10. Kết quả kháng sinh đồ MIC đối với K. Pneumoniae:…………………..67
Bảng 3.11. Kết quả kháng sinh đồ MIC đối với Pseudomonas aeruginosa:………68
Bảng 3.12. Kết quả kháng sinh đồ MIC đối với Escherichia coli:…………………69
Bảng 3.13. Kết quả kháng sinh đồ MIC đối với Burkholderia cepacia:…………..70
Bảng 3.14. Phân bố gene kháng thuốc phát hiện được:……………………………73
Bảng 3.15. Mối liên quan giữa gene kháng thuốc và đề kháng kháng sinh:……….74
Bảng 3.16. Kết quả người bệnh ra khỏi khoa chung:………………………………75
Bảng 3.17. Kết quả điều trị:………………………………………………………..75DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ tạo thư viện cho kỹ thuật NGS:………………………….………38
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ nghiên cứu:………………………………………………………47
Biểu đồ 3.1. Phân tích cụm trên 99 loài vi khuẩn định danh bằng giải trình tự 16SrRNA:………………………………………………………………………………53
Biểu đồ 3.2. Số loài vi khuẩn phát hiện được trên từng mẫu DRPQPN: ………….55
Biểu đồ 3.3. Mối liên quan giữa vi khuẩn phân lập được và số ngày nằm ICU:…..59
Biểu đồ 3.4. Mạng lưới của đa kháng kháng sinh đối với A. baumannii, K.
pneumoniae và P. aeruginosa:..……………………………………………………65
Biểu đồ 3.5. Tỉ lệ số kháng sinh bị đề kháng:………………………………………7