Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng chống oxy hóa và độc tính tế bào của cây Hồng quân

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng chống oxy hóa và độc tính tế bào của cây Hồng quân.Việt Nam có nền y học cổ truyền dân tộc lâu đời với nhiều kinh nghiệm sử dụng các loại dược liệu, các bài thuốc có giá trị để phòng bệnh và chữa bệnh, mặt khác còn là nơi có nhiều dược liệu đặc hữu quý hiếm, cung các bài thuốc cổ truyền có hiệu quả trị liệu tốt, nhưng một số không nhỏ trong đó lại đang dần bị lãng quên theo thời gian.
Xu hướng quay về sử dụng thuốc có nguồn gốc thiên nhiên thay cho thuốc có nguồn gốc tổng hợp là xu hướng phổ biến không chỉ ở Việt Nam mà còn rộng rãi trên toàn thế giới, khiến các nhà khoa học ngày càng hướng tới việc tìm kiếm tác dụng mới của cây thuốc và chứng minh tác dụng cho những bài thuốc dân gian để nâng cao giá trị sử dụng của cây thuốc từ thiên nhiên. Tuy vậy, xu hướng này cung mang lại những vấn đề lớn, đó là tình trạng ngày càng có nhiều bài thuốc không rõ nguồn gốc, chưa được chứng minh hiệu quả nhưng phổ biến lan truyền rất nhanh trong cộng đồng khiến người dân đổ xô đi tìm kiếm cây thuốc và sử dụng tự phát bừa bãi, tạo sự khan hiếm nguồn nguyên liệu đây giá thành dược liệu lên cao và cây Hồng quân là vi dụ điển hình trong những trường hợp đó.

Cây Hồng quân – một loài cây ăn quả quen thuộc ở vung đồng bằng Sông Cửu Long và Nam Trung Bộ, thuộc chi Flacourtia họ Liễu (Salicaceae), là cây thân gỗ, mọc hoang chủ yếu ở vung nhiệt đới [6], [5], [9]. Tại Việt nam, Hồng quân loài F.rukam được dân gian dung chữa viêm mi mắt, viêm khớp dạng thấp, gút, rễ chữa tiểu buốt, tiểu dắt, đặc biệt việc sử dụng rễ Hồng quân điều trị phì đại tiền liệt tuyến rất hiệu quả, dẫn đến tình trạng loài cây này đang bị khai thác triệt phá ồ ạt trong dân gian.
Trên thế giới, Hồng quân đã được nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa, tác dụng bảo vệ gan, hạ đường huyết, chống sốt rét và kháng khuân, chủ yếu nghiên cứu tập trung ở các loài: Flacourtia indica, Flacourtia montana, Flacourtia sepiaria, Flacourtia jangomas…. [62], [71], [133], [135]. Đặc biệt có loài đã được khảo sát tác dụng độc tinh tế bào như Flacourtia indica và tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh gút ức chế xanthin oxidase như Flacourtia sepiaria cho kết quả IC50 rất ấn tượng.2
Gút là bệnh rất phổ biến trên thế giới, một trong những nguyên nhân của bệnh gút là do tăng acid uric máu, xảy ra do rối lọan chuyển hóa acid uric. Xanthin oxidase (XO) là một enzyme đóng vai trò quan trọng trong gút chuyển hóa tạo acid uric. Trong giai đoạn cuối của quá trình trao đổi chất của purin, enzyme này xúc tác cho phản ứng oxy hóa hypoxanthin và xanthin để tạo thành acid uric. Do đó việc tìm kiếm những cây thuốc hay những hợp chất từ cây thuốc có tác dụng ức chế enzyme XO se có tiềm năng rất lớn góp phần hỗ trợ điều trị bệnh gút. Các nghiên cứu in vitro tiến hành cho kết quả tốt thường se được xác nhận kết quả bằng những thử nghiệm in vivo tiếp theo trong các nghiên cứu này.
Một vấn đề nổi cộm nữa ở Việt nam hiện nay đó là tỷ lệ bệnh ung thư trong người dân tăng rất nhanh. Theo số liệu được đưa ra tại Hội nghị khoa học phòng chống ung thư thường niên lần thứ 9 – tại Huế năm 2021, tỷ lệ mắc ung thư mới ở Việt Nam đã tăng lên 9 bậc, xếp thứ 90/185 quốc gia. Các loại ung thư thường gặp nhất vẫn là ung thư gan, đại trực tràng, ung thư vú, dạ dày, phổi …[145]. Với lý do đó hiện nay các nhà khoa học cung đang hướng đến các nghiên cứu tác dụng độc tinh trên các dòng tế bào ung thư của các cây thuốc dân gian nhằm mục đich tìm kiếm tác dụng mới của chúng, việc này là rất cấp bách và khả thi.
Kinh nghiệm dân gian sử dụng cây Hồng quân trị bi tiểu, tiểu dắt, tiểu khó cung đã được chứng minh có tác dụng điều trị u xơ lành tinh tiền liệt tuyến, thông qua kết quả nghiên cứu của đề tài “Nghiên cứu dịch chiết cao lỏng từ cây Bồ Quân ứng dụng điều trị u xơ lành tính tiền liệt tuyến” thực hiện tại Bệnh viện đa khoa Trung ương Thái Nguyên, kết quả nghiên cứu cho thấy có tác dụng tốt, đã được Hội đồng Khoa học Bộ Y tế nghiệm thu năm 2002 [8].
Nhận thấy Hồng quân là một cây thuốc giàu tiềm năng, không chỉ dừng lại ở một tác dụng mà có thể còn ân chứa nhiều hoạt tinh tiềm năng như 1 số cây thuốc cung chi khác. Đặc biệt cây Hồng quân loài Flacourtia rukam tại Việt Nam chưa thấy có nhiều báo cáo nghiên cứu về thành phần hóa học, tác dụng dược lý về loài này qua tham khảo tài liệu trên các tạp chi chuyên ngành có uy tin trong và ngoài nước.3
Nhằm chứng minh tác dụng dược lý theo y học cổ truyền Việt Nam và tìm kiếm tác dụng mới của cây Hồng quân, đặc biệt là theo hướng chống oxy hóa dập tắt gốc tự do (mô hình DPPH) và ức chế enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa (mô hình ức chế enzyme xanthin oxidase) trong tìm kiếm cây thuốc có tác dụng ức chế acid uric (phương pháp in vitro), làm hạ acid uric máu (phương pháp in vivo) phục vụ cho mục đich tìm kiếm cây thuốc hỗ trợ điều trị bệnh gút, và với mục đich đánh giá tinh độc tế bào của Flacourtia rukam mọc tại Việt Nam, từ đó góp phần tạo cơ sở cho việc bảo tồn, phát triển, nghiên cứu sản xuất sản phâm từ thiên nhiên đạt chất lượng cao, có hiệu quả hỗ trợ điều trị làm tăng giá trị sử dụng cây thuốc dân gian, nhóm nghiên cứu đặt vấn đề “Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng chống oxy hóa và độc tính tế bào của cây Hồng quân (Flacourtia rukam Zoll. Et Mor.)” với những mục tiêu cụ thể sau:
1. Xác định tên khoa học nguyên liệu nghiên cứu qua khảo sát hình thái thực vật, vi phẫu và định danh mẫu bằng giải trình tự ADN.
2. Khảo sát hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa và độc tinh tế bào của thân cây Hồng quân

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT …………………………………………… i
MỤC LỤC …………………………………………………………………………………………….. iii
DANH MỤC CÁC BẢNG …………………………………………………………………………….v
DANH MỤC CÁC HÌNH …………………………………………………………………………. viii
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ……………………………………………………………………………x
MỞ ĐẦU ……………………………………………………………………………………………….1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN …………………………………………………………………………4
1.1. Tổng quan về chi Flacourtia……………………………………………………………………..4
1.2. Tổng quan về Flacourtia rukam ………………………………………………………………26
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………….32
2.1. Đối tượng nghiên cứu……………………………………………………………………………32
2.2. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………………………………….36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU …………………………………………………….57
3.1. Kết quả khảo sát dược liệu Flacourtia rukam…………………………………………..57
3.2. Kết quả định tinh nguyên liệu ………………………………………………………………..70
3.3. Kết quả sàng lọc tác dụng sinh học …………………………………………………………72
3.4. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hợp chất……………………………………76
3.5. Xây dựng quy trình định lượng poliothrysosid trong thân Flacourtia rukam
bằng UPLC-PDA ……………………………………………………………………………………… 112
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ……………………………………………………………………….. 127
4.1. Về mặt thực vật học…………………………………………………………………………… 127iv
4.2. Về định tính nguyên liệu ……………………………………………………………………. 130
4.3. Sàng lọc tác dụng sinh học …………………………………………………………………. 131
4.4. Chiết xuất và phân lập các hợp chất trong F. rukam ……………………………….. 137
4.5. Về định lượng poliothrysosid trong mẫu dược liệu Hồng quân……………….. 142
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ………………………………………………………………….. 145
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ……….. 149
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Điểm khác biệt giữa các loài mang tên Hồng quân ở Việt Nam………………………7
Bảng 1.2. Flavon được phân lập từ các loài thuộc chi Flacourtia…………………………………..8
Bảng 1.3. Flavonol được phân lập từ các loài thuộc chi Flacourtia………………………………..9
Bảng 1.4. Các hợp chất phenolic glycosid…………………………………………………………………12
Bảng 1.5. Các dẫn chất acid quinic…………………………………………………………………………..14
Bảng 1.6. IC50 của dịch chiết lá F. indica trong thử nghiệm DPPH và NO ……………………18
Bảng 1.7. IC50 của 8 chất phân lập từ dịch quả F. inermis trong thử nghiệm DPPH ……….19
Bảng 1.8. Hoạt tính chống oxy hóa của chi Flacourtia……………………………………………….19
Bảng 1.9. MIC của dịch chiết từ lá F. indica đối với một số loài vi khuân……………………20
Bảng 1.10. MIC của dịch chiết từ lá F. indica đối với một số loài nấm…………………………21
Bảng 1.11. MIC của dịch chiết MeOH từ rễ F. indica trên một số vi khuân ………………….21
Bảng 1.12. % ức chế gốc tự do và IC50 của dịch chiết quả F. indica …………………………….23
Bảng 1.13. Các chế phâm có Flacourtia …………………………………………………………………..25
Bảng 1.14. Hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết và hợp chất từ vỏ thân F. rukam…………..29
Bảng 1.15. Hoạt tinh hạ cholesterol các cao chiết từ vỏ thân F. rukam …………………………30
Bảng 2.1. Ký hiệu mã hóa các mẫu dùng trong nghiên cứu …………………………………………32
Bảng 2.2. Danh mục thiết bị sử dụng thử nghiệm độc tính trên tế bào và XO………………..36
Bảng 2.3. Trình tự cặp mồi RbcL sử dụng trong phản ứng PCR…………………………………..38
Bảng 2.4. Thành phần thử tác dụng ức chế XO trong giếng của đĩa 96 …………………………46
Bảng 3.1. So sánh đặc điểm hình thái F. rukam và F. indica……………………………………….59
Bảng 3.2. So sánh sự khác biệt trình tự gen giữa mẫu HQ275 và HQ2941 ……………………69
Bảng 3.3. Mức độ tương đồng của 12 mẫu Hồng quân khi BLAST trên NCBI ……………..69
Bảng 3.4. Xác định độ âm, độ tro và hàm lượng chất chiết được của cao toàn phần……….70
Bảng 3.5. Kết quả phân tich sơ bộ thành phần hóa thực vật F. rukam…………………………..70
Bảng 3.6. Kết quả định lượng của cao toàn phần thân cành F. rukam ………………………….72
Bảng 3.7. Hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn bằng thử nghiệm DPPH ………73
Bảng 3.8. Hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn bằng năng lực khử sắt …………74
Bảng 3.9. % ức chế dòng tế bào MDA-MB-231 ………………………………………………………..74
Bảng 3.10. % ức chế dòng tế bào HepG2………………………………………………………………….75vi
Bảng 3.11. % ức chế dòng tế bào RD……………………………………………………………………….75
Bảng 3.12. Hoạt tinh độc tế bào của mẫu thử trên 3 dòng tế bào ung thư………………………75
Bảng 3.13. Dữ liệu phổ 1H -NMR và 13C -NMR (CDCl3 500 MHz, CDCl3 125 MHz) của
hợp chất (1) …………………………………………………………………………………………………………..83
Bảng 3.14. Dữ liệu phổ 1H -NMR và 13C -NMR (CDCl3 500 MHz, CDCl3 125 MHz) của
hợp chất (2) với acid chaumoogric (CDCl3 399,65 MHz; CDCl3 100,4 MHz)……………….86
Bảng 3.15. Dữ liệu phổ 1H -NMR và 13C -NMR của hợp chất (3) và poliothrysosid (CDCl3
500 MHz,  CDCl3 125 MHz) …………………………………………………………………………………88
Bảng 3.16. Dữ liệu phổ 1H -NMR và 13C -NMR ( DMSO-d6: 500 MHz, DMSO-d6: 125
MHz) của hợp chất (4) với Koabursid ( DMSO-d6: 400 MHz, DMSO-d6: 100 MHz) …….90
Bảng 3.17. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C -NMR hợp chất (5) với daucosterol ( DMSO-d6:
500 MHz, DMSO-d6: 125 MHz) ……………………………………………………………………………..92
Bảng 3.18. Dữ liệu phổ 1H -NMR và 13C -NMR hợp chất (6) (CDCl3 500 MHz, CDCl3 125
MHz)……………………………………………………………………………………………………………………95
Bảng 3.19. Dữ liệu phổ và 1H- NMR và 13C -NMR (DMSO-d6: 500 MHz, DMSO-d6: 125
MHz) của hợp chất (7)……………………………………………………………………………………………98
Bảng 3.20. Dữ liệu phổ và 1H- NMR và 13C -NMR (DMSO-d6: 500 MHz, DMSO-d6: 125
MHz) của hợp chất (8) và acid vanilic ……………………………………………………………………100
Bảng 3.21. Dữ liệu phổ và 1H- NMR và 13C -NMR (DMSO-d6 500 MHz, DMSO-d6
125MHz) của hợp chất (9) với stigmasterol (CDCl3 100 MHz)………………………………….102
Bảng 3.22. Dữ liệu phổ và 1H- NMR và 13C -NMR (CDCl3 500 MHz, CDCl3 125 MHz) của
hợp chất (10) và β-sitosterol (CDCl3 với một giọt MeOH-d4 100,06 MHz) …………………104
Bảng 3.23. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất (11)………………………………………………………105
Bảng 3.24. Hoạt tính chống oxy hóa các hợp chất bằng thử nghiệm DPPH …………………106
Bảng 3.25. Năng lực khử sắt và hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất………………….107
Bảng 3.26. Giá trị IC50 của các mẫu thử………………………………………………………………….108
Bảng 3.27. Kết quả tác dụng in vivo hạ acid uric máu của các mẫu thử ………………………109
Bảng 3.28. % ức chế và hoạt tinh độc tế bào MDA-MB-231 các cao phân đoạn ………….109
Bảng 3.29. Hoạt tinh độc tế bào ung thư vú người MDA-MB-231 của chất phân lập……110
Bảng 3.30. % ức chế hoạt tinh độc tế bào HepG2 …………………………………………………….110
Bảng 3.31. Hoạt tính độc tế bào ung thư gan người HepG2 của các mẫu thử……………….110
Bảng 3.32. % ức chế hoạt tinh độc tế bào RD ………………………………………………………….111
Bảng 3.33. Hoạt tính độc tế bào ung thư cơ vân người RD của các mẫu thử………………..111
Bảng 3.34. Kết quả đánh giá độ tinh khiết của poliothrysosid trên UPLC……………………113vii
Bảng 3.35. Kết quả khảo sát tinh tương thich hệ thống……………………………………………..119
Bảng 3.36. Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của poliothrysosid. …………….120
Bảng 3.37. Kết quả khảo sát độ lăp lại của poliothrysosid…………………………………………122
Bảng 3.38. Kết quả khảo sát độ đúng của poliothrysosid…………………………………………..122
Bảng 3.39. Hàm lượng poliothrysosid theo địa điểm thu hái ……………………………………..124
Bảng 3.40. Kết quả định lượng poliothrysosid theo bộ phận dùng của cây ………………….125
Bảng 3.41. Hàm lượng poliothrysosid theo thời điểm thu hái…………………………………….126
Bảng 4.1. So sánh điểm khác biệt trình tự gen giữa F. rukam và F. indica ………………….1