Nghiên cứu tính đa hình gen MBL2, FCN2 và nồng độ protein MBL, Ficolin-2 ở bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu tính đa hình gen MBL2, FCN2 và nồng độ protein MBL, Ficolin-2 ở bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue.Sốt xuất huyết Dengue (SXHD) là bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus Dengue gây ra, bệnh lây truyền qua muỗi Aedes. Trong khoảng 50 năm trở lại đây, tỉ lệ mắc SXHD tăng cao, đặc biệt ở các vùng địa lý mới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, xấp xỉ 3,9 tỷ người đang sống trong vùng dịch sốt xuất huyết và có khoảng 390 triệu ca nhiễm virus Dengue với khoảng 96 triệu ca có biểu hiện lâm sàng hàng năm [1].
Trong 10 năm trở lại đây, các nước khu vực Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương tiếp tục ghi nhận số bệnh nhân mắc SXHD tăng. Tại Việt Nam, tình hình dịch SXHD đã và đang diễn ra hết sức phức tạp trên cả nước đặc biệt ở các đô thị lớn như Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh. Năm 2018, cả nước có 126.682 số ca mắc với 17 ca tử vong. Năm 2019, số ca mắc tăng 2,5 lần và số ca tử vong tăng 3 lần với 320.702 trường hợp mắc SXHD và 54 trường hợp tử vong [2]. Trên thực tế, số ca mắc và tử vong có thể còn cao hơn nhiều. Trong thực hành lâm sàng, việc tiên lượng đúng các ca bệnh nặng sẽ giúp các bác sĩ lựa chọn được phác đồ hiệu quả để điều trị bệnh nhân. Tuy nhiên, việc tiên lượng này còn gặp rất nhiều khó khăn và hạn chế do thiếu các chỉ tiêu tiên lượng. Do đó, nghiên cứu sâu về cơ chế bệnh sinh của SXHD từ đó có thể đưa ra các yếu tố dùng làm chỉ tiêu tiên lượng các ca bệnh nặng là rất cần thiết và hữu ích cho công tác điều trị bệnh.

Trong quá trình virus Dengue xâm nhập vào cơ thể, hệ thống miễn dịch bẩm sinh phản ứng sớm nhất chống lại sự xâm nhập và nhân lên của virus. Hệ thống bổ thể gồm một nhóm các protein trong huyết thanh là một thành phần quan trọng của hệ thống miễn dịch bẩm sinh. Thông qua các cơ chế: làm tan tế bào, opsonin hóa, tăng cường đáp ứng viêm, hệ thống bổ thể bảo vệ cơ thể chống lại rất nhiều tác nhân gây bệnh [3]. Để thực hiện được chức năng, các protein bổ thể cần được hoạt hóa. Một trong những con đường hoạt hóa bổ thể quan trọng, tham gia vào cơ chế bệnh sinh của nhiều bệnh lý là con đường lectin với vai trò then chốt của 2 protein Mannose Binding Lectin (MBL) và Ficolin-2 [3]. Thông qua vùng nhận diện tác nhân trong cấu trúc phân tử, MBL và Ficolin-2 có khả năng gắn đặc hiệu với các phân tử trên bề mặt các tác nhân gây bệnh, từ đó hoạt hóa hệ thống bổ thể theo con đường lectin bảo vệ cơ thể chống lại các tác nhân đó [3]. 
Nồng độ MBL và tính đa hình gen MBL2 đã được chỉ ra có liên quan đến nhiễm nhiều loại virus khác nhau như HIV, HBV, HCV và đặc biệt là một số virus trong họ Flaviviridae như WNV [4], [5], [6], [7]. Trong nghiên cứu này, MBL được chỉ ra là có khả năng gắn vào đầu có chứa N-Linked glycan trên vỏ virus từ đó trung hòa và thanh thải hiệu quả virus [7]. Giống như MBL, Ficolin-2 cũng đã được chỉ ra đóng một vai trò quan trọng trong nhiễm một số loại virus ở người như HBV, HCV [8], [9]. Là một loại trong họ Flaviviridae, vỏ của virus Dengue có chứa N-Linked glycan là phối tử cho MBL và Ficolin-2 gắn vào, từ đó trung hòa và thanh thải virus [7]. Do đó, nồng độ và chất lượng MBL và Ficolin-2 có thể đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của SXHD. Tuy nhiên, các nghiên cứu về vai trò của hai protein MBL, Ficolin-2 và các gen MBL2 và FCN2 mã hóa cho hai protein này ở bệnh nhân mắc SXHD còn khá hạn chế và hoàn toàn mới trên quần thể người Việt. Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tính đa hình gen MBL2, FCN2 và nồng độ protein MBL, Ficolin-2 ở bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue” với hai mục tiêu:
1. Xác định tính đa hình các gen MBL2, FCN2 và định lượng nồng độ protein MBL, Ficolin-2 ở bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue.
2. Phân tích mối liên quan giữa tính đa hình các gen MBL2, FCN2, nồng độ protein MBL, Ficolin-2 với mức độ bệnh và một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue.

MỤC LỤC

   Trang phụ bìa
   Lời cam đoan
   Lời cảm ơn
Mục lục    
Danh mục chữ viết tắt    
Danh mục các bảng     
Danh mục các hình    
ĐẶT VẤN ĐỀ    1
Chương  1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU    3
1.1. Dịch tễ học bệnh sốt xuất huyết Dengue    3
1.1.1. Tình hình sốt xuất huyết Dengue trên thế giới    3
1.1.2. Tình hình SXHD ở Việt Nam    4
1.2. Cơ chế bệnh sinh của sốt xuất huyết Dengue    5
1.3. Hệ thống bổ thể    9
1.3.1. Hệ thống bổ thể    9
1.3.2. Con đường lectin hoạt hóa bổ thể    13
1.4. Protein MBL và gen MBL2    14
1.4.1. Protein MBL    14
1.4.2. Gen MBL2 và tính đa hình gen MBL2    20
1.5. Protein Ficolin-2 và gen FCN2    24
1.5.1. Protein Ficolin-2    24
1.5.2. Gen FCN2 và tính đa hình gen FCN2    27
1.6. Vai trò của MBL, Ficolin-2 và tính đa hình gen MBL2, FCN2 trong sốt xuất huyết Dengue    29
1.6.1. Vai trò của MBL và đa hình gen MBL2 trong sốt xuất huyết Dengue    29
1.6.2. Vai trò của Ficolin-2 và đa hình gen FCN2 trong sốt xuất huyết Dengue    30
1.7. Tình hình nghiên cứu về vai trò của protein MBL và Ficolin-2 và tính đa hình của các gen MBL2 và FCN2 trong bệnh sốt xuất huyết Dengue    31
Chương  2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU    33
2.1. Đối tượng nghiên cứu    33
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu    33
2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân    33
2.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ    35
2.2. Phương pháp nghiên cứu    36
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu    36
2.2.2. Cách chọn mẫu    37
2.2.3. Các phương tiện nghiên cứu    37
2.2.4. Các bước tiến hành    37
2.3. Nội dung nghiên cứu    39
2.3.1. Chỉ tiêu về dịch tễ    39
2.3.2. Chỉ tiêu về lâm sàng, cận lâm sàng    39
2.3.3. Xác định nồng độ Ficolins-2 và MBL trong huyết thanh    41
2.4. Phân tích kết quả    48
2.5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu    49
2.6. Đạo đức nghiên cứu    49
Chương  3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU    50
3.1. Một số đặc điểm nhóm bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue    50
3.1.1. Đặc điểm tuổi và giới    50
3.1.2. Một số chỉ tiêu lâm sàng, cận lâm sàng    50
3.2. Tính đa hình gen MBL2, FCN2 và nồng độ protein MBL, Ficolin-2 ở các nhóm đối tượng nghiên cứu    53
3.2.1. Tính đa hình gen MBL2 ở các nhóm đối tượng nghiên cứu    53
3.2.2. Tính đa hình gen FCN2 ởcác nhóm đối tượng nghiên cứu    56
3.2.3. Đặc điểm nồng độ protein MBL, Ficolin-2 ở các nhóm đối tượng nghiên cứu    60
3.3. Mối liên quan giữa tính đa hình gen MBL2, FCN2 và nồng độ MBL, Ficolin-2 với mức độ bệnh và một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh sốt xuất huyết Dengue    61
3.3.1. Mối liên quan giữa tính đa hình gen MBL2 và mức độ bệnh, một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh sốt xuất huyết Dengue    61
3.3.2. Mối liên quan giữa tính đa hình gen FCN2 với  mức độ bệnh và một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh sốt xuất huyết Dengue    72
3.3.3. Mối liên quan giữa nồng độ  protein  MBL với mức độ bệnh và một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh sốt xuất huyết Dengue    80
3.3.4. Mối liên quan giữa nồng độ Ficolin-2 với mức độ bệnh và một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh sốt xuất huyết Dengue    84
3.3.5. Mối liên quan giữa tính đa hình gen MBL2 và nồng độ MBL huyết thanh ở bệnh sốt xuất huyết Dengue    87
3.3.6. Mối liên quan giữa tính đa hình gen FCN2 và nồng độ protein Ficolin-2 ở bệnh sốt xuất huyết Dengue    90
Chương  4: BÀN LUẬN    95
4.1. Đặc điểm chung nhóm bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue    95
4.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới    96
4.1.2. Một số chỉ tiêu lâm sàng và cận lâm sàng    96
4.2. Về tính đa hình gen MBL2, FCN2 và nồng độ protein MBL, Ficolin-2 ở các nhóm đối tượng nghiên cứu    100
4.2.1. Về tính đa hình gen MBL2 ở các nhóm đối tượng nghiên cứu    100
4.2.2. Về tính đa hình gen FCN2 ở các nhóm đối tượng nghiên cứu    102
4.2.3. Đặc điểm nồng độ protein MBL, Ficolin-2 ở các nhóm đối tượng nghiên cứu    104
4.3. Về mối liên quan giữa tính đa hình gen MBL2, FCN2 và nồng độ MBL, Ficolin-2 với mức độ bệnh và một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh sốt xuất huyết Dengue    105
4.3.1. Mối liên quan giữa tính đa hình gen MBL2 và mức độ bệnh, một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh sốt xuất huyết Dengue    105
4.3.2. Mối liên quan giữa tính đa hình gen FCN2 với mức độ bệnh và một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh sốt xuất huyết Dengue    110
4.3.3. Mối liên quan giữa nồng độ protein MBL với mức độ bệnh và một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh sốt xuất huyết Dengue    114
4.3.4. Về mối liên quan giữa nồng độ Ficolin-2 với mức độ bệnh và một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh sốt xuất huyết Dengue    115
4.3.5. Về mối liên quan giữa tính đa hình gen MBL2 và nồng độ MBL huyết thanh ở bệnh sốt xuất huyết Dengue    119
4.3.6. Về mối liên quan giữa tính đa hình gen FCN2 và nồng độ protein Ficolin-2 ở bệnh sốt xuất huyết Dengue    122
KẾT LUẬN    
KIẾN NGHỊ    
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN    
TÀI LIỆU THAM KHẢO    
PHỤ LỤC    

DANH MỤC CÁC BẢNG    

Bảng    Tên bảng    Trang
2.1    Trình tự các cặp mồi đặc hiệu    46    46
3.1    Đặc điểm tuổi, giới ở bệnh nhân nghiên cứu    50    50
3.2    Một số chỉ tiêu lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân nghiên cứu        50
3.3    Đặc điểm kháng nguyên, kháng thể đặc hiệu virus Dengue ở bệnh nhân nghiên cứu    51    51
3.4    Tần suất kiểu gen, alen các điểm đa hình vùng Promoter gen MBL2 ở các nhóm nghiên cứu    53    53
3.5    Tần suất kiểu gen, alen các điểm đa hình vùng exon 1 gen MBL2 ở các nhóm nghiên cứu    54    54
3.6    Tần suất kiểu gen đơn bội, lưỡng bội của đa hình (-221)+exon 1 gen MBL2 ở các nhóm nghiên cứu    55    55
3.7    Tần suất các kiểu gen đơn bội gen MBL2 ở các nhóm nghiên cứu    56
3.8    Tần suất kiểu gen và alen các điểm đa hình vùng promoter gen FCN2 ở các nhóm nghiên cứu    57    57
3.9    Tần suất kiểu gen và alen các điểm đa hình vùng exon 7; intron 7; exon 8 gen FCN2 ở các nhóm nghiên cứu    58    58
3.10    Tần suất kiểu gen đơn bội tạo bởi 3 SNP (+6031/+6220/+6424) gen FCN2 ở các nhóm nghiên cứu    59    59
3.11    Tần suất các kiểu gen đơn bội tạo bởi 8 SNP gen FCN2 ở các nhóm nghiên cứu    60    60
3.12    Đặc điểm nồng độ MBL ở các nhóm nghiên cứu    60    60
3.13    Đặc điểm nồng độ Ficolin-2 ở các nhóm nghiên cứu    61    61
3.14    So sánh tần suất kiểu gen và kiểu alen các điểm đa hình vùng Promoter gen MBL2 giữa các nhóm nghiên cứu.    62    62
3.15    So sánh kiểu gen và kiểu alen các điểm đa hình vùng exon 1 gen MBL2giữa các nhóm nghiên cứu.    63    63
3.16    So sánh tần suất kiểu gen đơn bội, lưỡng bội của đa hình (-221)+exon 1 gen MBL2giữa các nhóm nghiên cứu    67    67
3.17    So sánh tần suất các kiểu gen đơn bội gen MBL2giữa các nhóm nghiên cứu    70    70
3.18    So sánh tần suất kiểu gen và alen các điểm đa hình vùng exon 7 ; intron 7; exon 8 gen FCN2 giữa các nhóm nghiên cứu    72    72
3.19    So sánh tần suất kiểu gen đơn bội tạo bởi 3 SNP (+6031/+6220/+6424) gen FCN2 giữa nhóm bệnh và nhóm chứng        77
3.20    So sánh tần suất kiểu gen đơn bội tạo bởi 8 SNP gen FCN2 giữa nhóm bệnh và nhóm chứng    78    78
3.21    Tương quan giữa nồng độ MBL và các triệu chứng cận lâm sàng        82
3.22    Giá trị phân biệt 2 nhóm bệnh DHF và DWS của protein MBL    83    83
3.23    Tương quan giữa nồng độ Ficolin-2 và các triệu chứng cận lâm sàng        86
3.24    Giá trị phân biệt 2 nhóm bệnh DHF và DWS của protein Ficolin-2        87

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình    Tên hình    Trang
1.1    Phân bố tình hình SXHD trên thế giới giai đoạn 2010- 2016    3
1.2    Số ca sốt xuất huyết Dengue nhập viện và tử vong theo tuần năm 2018 và 2019    4
1.3    Cơ chế bệnh sinh của sốt xuất huyết Dengue    5
1.4    Các con đường hoạt hóa bổ thể    12
1.5    Bước đầu khởi động con đường lectin    14
1.6    Cấu trúc phân tử protein MBL    15
1.7    Mô hình kết quả phân tách hỗn hợp MBL bằng kỹ thuật SDS-PAGE    16
1.8    Đa hình gen MBL2    21
1.9    Cây tiến hóa MBL2    24
1.10    Cấu trúc đa bậc của protein Ficolin và MBL    25
1.11    Đa hình đơn Nucleotit trên gen FCN2    28
2.1    Máy Diagnostic Automation đo mật độ quang ở bước sóng 450 nm    41
2.2    Bộ kít định lượng Ficolin-2 trong huyết thanh bằng phương pháp ELISA tiến hành trong nghiên cứu    42
2.3    Máy và phần mềm định lượng miễn dịch Luminex    43
2.4    Bộ kít định lượng MBL trong huyết thanh bằng máy Luminex dùng trong nghiên cứu    44
2.5    Máy nhân gen Eppendorf    47
3.1    Hoạt độ enzym GOT và GPT ở hai nhóm bệnh nhân dương tính và âm tính với kháng thể IgG và IgM đặc hiệu virus Dengue    52
3.2    Mối liên quan giữa đa hình -550C/G gen MBL2 và một số biểu hiện cận lâm sàng ở bệnh nhân SXHD    64
3.3    Mối liên quan giữa đa hình -221C/G gen MBL2 và một số biểu hiện cận lâm sàng ở bệnh nhân SXHD    65
3.4    Mối liên quan giữa đa hình +4G/A gen MBL2 và một số biểu hiện lâm sàng ở bệnh nhân SXHD    65
3.5    Mối liên quan giữa các đa hình trên exon 1 gen MBL2 và một số biểu hiện cận lâm sàng ở bệnh nhân SXHD    66
3.6    Mối liên quan giữa kiểu gen đơn bội tạo bởi điểm -221C/G + exon 1 gen MBL2 và một số biểu hiện cận lâm sàng ở bệnh nhân SXHD    68
3.7    Mối liên quan giữa kiểu gen lưỡng bội tạo bởi điểm -221C/G + exon 1 gen MBL2 và một số biểu hiện cận lâm sàng ở bệnh nhân SXHD    69
3.8     Mối liên quan giữa kiểu gen đơn bội tạo bởi 6 điểm đa hình gen MBL2 và một số biểu hiện cận lâm sàng ở bệnh nhân SXHD    71
3.9     Mối liên quan giữa đa hình +6031A/G gen FCN2 và một số biểu hiện cận lâm sàng ở bệnh nhân SXHD    74
3.10    Mối liên quan giữa đa hình +6220T/G gen FCN2 và một số biểu hiện cận lâm sàng ở bệnh nhân SXHD    75
3.11     Mối liên quan giữa đa hình +6424G/T gen FCN2 và một số biểu hiện cận lâm sàng ở bệnh nhân SXHD    76
3.12    Mối liên quan giữa kiểu gen đơn bội tạo bởi 3 SNP (+6031/+6220/+6424) gen FCN2 và một số biểu hiện cận lâm sàng ở bệnh nhân SXHD    77
3.13    Mối liên quan giữa kiểu gen đơn bội tạo bởi 8 SNP gen FCN2 và một số biểu hiện cận lâm sàng ở bệnh nhân SXHD    79
3.14    So sánh nồng độ protein MBL ở các nhóm nghiên cứu    80
3.15    So sánh nồng độ protein MBL giữa các nhóm âm tính và dương tính với kháng nguyên NS1 và kháng thể IgG, IgM đặc hiệu với virus Dengue    81
3.16    So sánh nồng độ protein MBL ở nhóm có và không có đấu hiệu xuất huyết    81
3.17    So sánh nồng độ protein MBL ở nhóm bệnh nhân nam và nữ    82
3.18    Biểu đồ đường cong ROC của protein MBL trong phân biệt 2 nhóm bệnh DHF và DWS    83
3.19    So sánh nồng độ protein Ficolin-2 giữa các nhóm nghiên cứu    84
3.20    So sánh nồng độ protein Ficolin-2 giữa các nhóm âm tính và dương tính với kháng nguyên NS1 và kháng thể IgG, IgM đặc hiệu với virus Dengue    85
3.21    So sánh nồng độ protein Ficolin-2 giữa có và không có dấu hiệu suất huyết    85
3.22    So sánh nồng độ protein Ficolin-2 giữa hai nhóm bệnh nhân nam và nữ    86
3.23    Biểu đồ đường cong ROC của protein Ficolin-2 trong phân biệt 2 nhóm bệnh DHF và DWS    87
3.24    Nồng độ protein MBL ở các kiểu gen khác nhau ở nhóm DHF    88
3.25    Nồng độ protein MBL trên các kiểu gen khác nhau ở nhóm DWS    88
3.26    Nồng độ protein MBL trên các kiểu gen khác nhau ở nhóm chứng    89
3.27    Nồng độ protein MBL trên các kiểu gen đơn bội khác nhau ở nhóm chứng và nhóm bệnh    90
3.28    So sánh nồng độ protein Ficolin-2 giữa các kiểu gen của các điểm đa hình gen FCN2 ở nhóm bệnh    91
3.29    So sánh nồng độ protein Ficolin-2 giữa các kiểu gen của các điểm đa hình gen FCN2 ở nhóm chứng    92
3.30    So sánh nồng độ protein Ficolin-2 giữa các kiểu gen đơn bội của 3 SNP (+6031/+6220/+6424) gen FCN2 ở nhóm chứng và nhóm bệnh    93
3.31    So sánh nồng độ protein Ficolin-2 giữa các kiểu gen đơn bội của 8 SNP gen FCN2 ở nhóm chứng và nhóm bệnh        93