NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘC TỒ GÂY TIÊU CHẢY ACID OKADAIC, DINOPHYSISTOXIN-1, DINOPHYSISTOXIN-2

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘC TỒ GÂY TIÊU CHẢY ACID OKADAIC, DINOPHYSISTOXIN-1, DINOPHYSISTOXIN-2 TRONG MỘT SỒ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Ở BIỂN VIỆT NAM BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỒI PHỔ.Vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong những vấn đề có tầm quan trọng thường trực cho việc đảm bảo chất lượng cuộc sống của cả cộng đồng và đang nhận được sự quan tâm sát sao của toàn xã hội tại Việt Nam hiện nay. Trong lĩnh vực này, nổi cộm hơn cả là việc thực phẩm bị “nhiễm bẩn” bởi các tác nhân gây hại tới sức khỏe con người có nguồn gốc rất đa dạng, song tựu chung lại có thể phân loại thành 2 nhóm lớn: Thứ nhất, đó là những chất độc hại nhiễm vào thực phẩm do các hoạt động vô ý hay cố ý của con người, như lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật trong canh tác cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hay việc lạm dụng kháng sinh, chất kích thích tăng trưởng trong nuôi trồng thủy sản, chăn nuôi gia súc, hoặc những chất thải độc hại ngấm vào thực phẩm qua các hoạt động khác của con người như sản xuất công nghiệp, xả thải công nghiệp, rác thải sinh hoạt bừa bãi ra khí quyển, nguồn nước…

Thứ hai là những độc tố mang nguồn gốc tự nhiên xâm nhập, tích lũy trong thực phẩm, trong đó điển hình có thể kể đến các độc tố vi nấm trong các loại hạt ngũ cốc, các độc tố vi tảo [13], [88] và vi khuẩn trong các loại thủy hải sản, nhất là các loại nhuyễn thể. Trong số các độc tố tự nhiên có thể tích lũy trong thực phẩm, cho tới nay những nghiên cứu đã được công bố cho thấy các độc tố do các loài vi tảo hai roi sản xuất là nguyên nhân gây ra rất nhiều hội chứng ngộ độc cho người. Khả năng gây độc rất đa dạng, trong đó hay gặp nhất là các triệu chứng trên hệ thần kinh (gây tê liệt, hôn mê, mất trí n h ớ ., có thể tử vong trong các vụ ngộ độc nghiêm trọng) và hệ tiêu hóa (đau bụng, tiêu chảy, nôn mửa…), dẫn tới những vụ ngộ độc ở quy mô khác nhau tại nhiều nơi trên thế giới [33], [133]. Trong các hội chứng ngộ độc đường tiêu hóa do độc tố của vi tảo hai roi gây ra có hội chứng tiêu chảy do ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (Diarrhetic Shellfish Poisoning – DSP) với tác nhân là nhóm độc tố gồm acid okadaic (OA) và các dẫn xuất gọi chung là dinophysistoxin (DTX) [11].
Hiện tại ở Việt Nam, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã ban hành Thông tư số 33/2015/TT-BNNVPTNT quy định về giám sát vệ sinh, an toàn thực phẩm trong thu hoạch nhuyễn thể hai mảnh vỏ trong đó có quy định giới hạn tổng của OA, các DTX và pectenotoxin (PTX) là 160 ppb [1]. Tuy nhiên, 1việc đánh giá nguy cơ có mặt của các độc tố nhóm OA trong nhuyễn thể tại Việt Nam vẫn chưa được thực hiện một cách có hệ thống, ngoại trừ một số nghiên cứu khoanh vùng ở các khu nuôi thủy sảnnhư nghiên cứu của Viện Nghiên cứu hải sản tiến hành ở 3 vùng nuôi ngao tập trung vào năm 2003 [5].
Bên cạnh đó, phương pháp chính thức hiện tại của TCVN 8341: 2010 [2] chỉ cho phép xác định OA, không cho phép xác định các DTX, còn phương pháp bán định lượng trên chuột (MBA) có thể cho kết quả dương tính cả với các nhóm hợp chất thân dầu chưa ghi nhận có độc tính trên người như PTX, yessotoxin (YTX). Do vậy, cần có phương pháp đặc hiệu hơn để xác định chính xác OA và các DTX, thủ phạm chính gây hội chứng DSP. Để góp phần đưa ra các giải pháp phân tích đặc hiệu hơn, cũng như đánh giá toàn diện hơn sự có mặt của độc tố nhóm OA trong nhuyễn thể tại Việt Nam, luận án: “NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘC TỒ GÂY TIÊU CHẢY ACID OKADAIC, DINOPHYSISTOXIN-1, DINOPHYSISTOXIN-2 TRONG MỘT SỒ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Ở BIỂN VIỆT NAM BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỒI PHỔ “
được thực hiện nghiên cứu với 2 mục tiêu sau:
Mục tiêu 1: Xây dựng phương pháp định lượng các độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin-1, dinophysistoxin-2 bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ.
Mục tiêu 2: Xác định hàm lượng các độc tố kể trên trong một số nhóm nhuyễn thể hai mảnh vỏ được lấy tại các vùng biển Việt Nam

MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN Đ Ề…………………………………………………………………………………………… 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN…………………………………………………………………….. 3
1.1. ĐỘC TỐ SINH VẬT BIỂN……………………………………………………………………. 3
1.1.1. Nguồn gốc……………………………………………………………………………………….. 3
1.1.2. Tóm tắt quá trình nghiên cứu một số nhóm độc tố tảo đơn bào gây độc 4
cho con người…………………………………………………………………………..
1.2. NGUỒN GỐC, CẤU TRÚC HOÁ HỌC, ĐỘC TÍNH VÀ QUY ĐỊNH KIỂM
SOÁT ĐỘC TỐ DSP…………………………………………………………………………………….. 7
1.2.1. Nguồn gốc độc tố DSP……………………………………………………………………… 7
1.2.2. Cấu trúc hoá học độc tố DSP………………………………………………………………. 8
1.2.3. Cơ ch ế tác dụng, độc tính độc tố DSP………………………………………………….. 10
1.2.4. Ngộ độc cho người do độc tố DSP……………………………………………………… 11
1.2.5. Quy định kiểm soát độc tố DSP…………………………………………………………… 12
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ DSP…………………………………… 16
1.3.1. Các phương pháp xử lý m ẫu để chiết độc tố nhóm acid okadaic…………… 16
1.3.1.1. Lựa chọn dung môi để chiết độc tố nhóm OA từ nhuyễn thể………………. 17
1.3.1.2. Các phương pháp làm sạch dịch chiết ban đầu………………………………….. 18
1.3.1.3. Các phương pháp thuỷ phân mẫu và làm sạch sau thuỷ phân……………… 20
1.3.2. Các phương pháp sinh học để phân tích độc tố nhóm acid okadaic………. 21
iii1.3.2.1. Các phương pháp định lượng sinh học in vivo………………………………….. 21
1.3.2.2. Các phương pháp định lượng qua gây độc tế bào………………………………. 22
1.3.2.3. Các phương pháp hoá sinh………………………………………………………………. 23
1.3.3. Các phương pháp hoá lý để phân tích độc tố nhóm acid okadaic………….. 24
1.3.3.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao……………………………………………………………….. 24
1.3.3.2. Điện di mao quản……………………………………………………………………………. 26
1.3.3 3. Sắc ký khí……………………………………………………………………………………….. 27
1.4. ỨNG DỤNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ TRONG PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ NHÓM
ACID OKADAIC………………………………………………………………………………………….. 27
1.4.1. Các đặc trưng khối phổ của độc tố nhóm OA……………………………………….. 27
1.4.1.1. Khối phổ của OA trong kỹ thuật EI và CI…………………………………………. 27
1.4.1.2. Khối phổ của OA trong kỹ thuật FAB……………………………………………… 28
1.4.1.3. Khối phổ của OA trong kỹ thuật ESI………………………………………………… 29
1.4.1.4. Khối phổ dạng ester của OA…………………………………………………………….. 34
1.4.2. Phân tích định tính, định lượng độc tố nhóm OA bằng LC – MS/MS…….. 36
1.4.2.1. Kỹ thuật ion hoá……………………………………………………………………………… 36
1.4.2.2. Lựa chọn phân tích khối………………………………………………………………….. 37
1.4.2.3. Điều kiện sắc ký……………………………………………………………………………… 38
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U…………………………………………………………….. 43
2.1. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ………………………………………………………… 43
2.1.1. Dung môi, hoá chất và chất chuẩn………………………………………………………. 43
2.1.1.1. Chất chuẩn……………………………………………………………………………………… 43
iv2.1.1.2. Dung môi, hoá chất………………………………………………………………………… 43
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ phân tích……………………………………………………………….. 43
2.1.2.1. Thiết bị phân tích…………………………………………………………………………….. 43
2.1.2.2. Dụng cụ phân tích……………………………………………………………………………. 44
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU……………………………………………………………… 45
2.2.1. Mẫu nhuyễn thể lấy tại các địa phương………………………………………………… 45
2.2.2. Mẫu thêm chuẩn………………………………………………………………………………… 45
2.2.3. Mẫu chuẩn nhuyễn thể có chứa độc tố …………………………………………………. 45
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………… 46
2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời OA, DTX1, DTX2 trong
nhuyễn thể…………………………………………………………………………………………………… 46
2.3.1.1. Khảo sát xây dựng điều kiện khối phổ……………………………………………… 46
2.3.1.2. Khảo sát xây dựng điều kiện sắc ký………………………………………………….. 47
2.3.1.3. Khảo sát điều kiện chiết độc tố từ mẫu nhuyễn thể……………………………. 48
2.3.1.4. Khảo sát điều kiện thuỷ phân để phân tích độc tố toàn phần………………. 48
2.3.1.5. Thẩm định phương pháp………………………………………………………………….. 49
2.3.2. Lấy mẫu nhuyễn thể và bảo quản mẫu………………………………………………. 51
2.3.2.1. Lựa chọn số lượng cá thể cho mỗi mẫu nhuyễn thể……………………………. 51
2.3.2.2. Khảo sát điều kiện bảo quản mẫu nhuyễn thể……………………………………. 51
2.3.3. Phân tích độc tố trong mẫu nhuyễn thể và biện giải kết quả………………… 51
2.3.3.1. Tiến hành phân tích trên mẫu thực……………………………………………………. 51
2.3.3.2. Các tiêu chí đánh giá kết quả phân tích độc tố trong nhuyễn thể…………. 52
2.3.3.3. Các hướng biện giải, bàn luận kết quả……………………………………………… 52
vCHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨ U………………………………………………….. 53
3.1. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2……………… 53
3.1.1. Khảo sát thiết lập điều kiện phân tích OA, DTX1 và DTX2 bằng M S…… 53
3.1.1.1. Điều kiện của detector MS/MS……………………………………………………….. 53
3.1.1.2. Điều kiện sắc ký……………………………………………………………………………… 59
3.1.2. Khảo sát thiết lập điều kiện xử lý mẫu để chiết OA, DTX1 và DTX2 từ
nhuyễn thể…………………………………………………………………………………………………… 65
3.1.2.1. Đồng nhất mẫu……………………………………………………………………………….. 65
3.1.2.2. Lựa chọn dung môi chiết độc tố……………………………………………………….. 65
3.1.2.3. Lựa chọn thể tích dung môi chiết……………………………………………………… 67
3.1.2.4. Khảo sát điều kiện làm sạch dịch chiết…………………………………………….. 68
3.1.2.5. Điều kiện xử lý m ẫu để phân tích độc tố ở dạng tự do………………………… 73
3.1.2.6. Khảo sát thiết lập điều kiện thuỷ phân để phân tích OA, DTX1 và
DTX2 toàn phần trong nhuyễn thể……………………………………………………………….. 74
3.1.3. Khảo sát thiết lập điều kiện bảo quản nhuyễn thể………………………………. 79
3.1.3.1. Đánh giá độ ổn định của độc tố trong nhuyễn thể ở một số điều kiện
nhiệt độ………………………………………………………………………………………………………. 79
3.1.3.2. Điều kiện bảo quản mẫu nhuyễn thể…………………………………………………. 82
3.2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2……….. 82
3.2.1. Điều kiện của các phương pháp được thẩm định………………………………….. 82
3.2.1.1. Phương pháp phân tích độc tố tự do trên cột Cortecs…………………………. 82
3.2.1.2. Phương pháp phân tích độc tố tự do và toàn phần trên cột Zorbax……… 84
3.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích độc tố trên cột Cortecs…………………. 85
vi3.2.2.1. Độ đặc hiệu……………………………………………………………………………………. 85
3.2.2.2. Độ thích hợp hệ thống…………………………………………………………………….. 87
3.2.2.3. Độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm việc……………………………………… 88
3.2.2.4. Độ chính xác…………………………………………………………………………………… 88
3.2.2.5. Độ đúng………………………………………………………………………………………….. 91
3.2.2.6. Độ nhậy………………………………………………………………………………………….. 92
3.2.3. Thẩm định phân tích độc tố tự do và toàn phần trên cột Zorbax…………….. 94
3.2.3.1. Độ đặc hiệu…………………………………………………………………………………….. 94
3.2.3.2. Độ thích hợp hệ thống…………………………………………………………………….. 96
3.2.3.3. Độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm việc……………………………………… 97
3.2.3.4. Độ chính xác khi phân tích độc tố tự do……………………………………………. 98
3.2.3.5. Độ chính xác khi xác định độc tố toàn phần………………………………………. 101
3.2.3.6. Độ đúng khi phân tích độc tố tự do…………………………………………………… 103
3.2.3.7. Độ đúng khi phân tích độc tố toàn phần……………………………………………. 104
3.2.3.8. Độ nhậy………………………………………………………………………………………….. 104
3.3. PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2 TRONG MẪU NHUYỄN THỂ……………… 107
3.3.1. Lấy mẫu nhuyễn thể và phân tích độc tố……………………………………………… 107
3.3.2. Kết quả phân tích độc tố trong mẫu nhuyễn thể……………………………………. 109
3.3.2.1. Kết quả phát hiện độc tố tự do…………………………………………………………… 109
3.3.2.2. Kết quả phát hiện độc tố sau khi thuỷ phân……………………………………….. 111
3.3.3. Sự phân bố các mẫu phát hiện có độc tố ……………………………………………….. 113
3.3.3.1. Phân bố các mẫu có độc tố theo loại nhuyễn thể……………………………….. 113
3.3.3.2. Phân bố các mẫu có độc tố theo địa điểm lấy mẫu……………………………… 116
vii3.3.3.3. Phân bố các mẫu có độc tố theo thời điểm lấy mẫu…………………………….. 119
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN………………………………………………………………………….. 122
4.1. BÀN LUẬN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐƯỢC XÂY DỰNG……………….. 122
4.1.1. Điều kiện phân tích độc tố bằng LC – MS/MS……………………………………… 122
4.1.2. Điều kiện xử lý mẫu nhuyễn thể…………………………………………………………. 126
4.1.2.1. Cỡ mẫu nhuyễn thể………………………………………………………………………….. 126
4.1.2.2. Điều kiện xử lý m ẫu để phân tích độc tố tự do…………………………………… 126
4.1.2.3. Điều kiện xử lý m ẫu để phân tích độc tố toàn phần……………………………. 127
4.2. BÀN LUẬN KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ TRONG NHUYỄN THỂ………. 129
4.2.1. Loại độc tố phát hiện được, tỷ lệ xuất hiện và mức độ hàm lượng trong
nhuyễn thể…………………………………………………………………………………………………… 129
4.2.2. Dao động sự xuất hiện của độc tố trong nhuyễn thể cùng các yếu tố ảnh
hưởng…………………………………………………………………………………………………………. 131
4.3. NGUY CƠ ẢNH HƯỞNG TỚI SỨC KHOẺ VÀ HƯỚNG KIỂM SOÁT ĐỘC
TỐ NHÓM OA TRONG NHUYỄN THỂ TRONG TƯƠNG LAI………………………… 140
KÉT LUẬN VÀ KIÉN N G H Ị……………………………………………………………………. 142
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC