Phân lập, tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi-thai thành tế bào dạng tiết dopamin

Phân lập, tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi-thai thành tế bào dạng tiết dopamin

Luận án tiến sĩ y học Phân lập, tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi-thai thành tế bào dạng tiết dopamin.Ngày nay, việc nghiên cứu và ứng dụng những hiểu biết ở cấp độ tế bào và dưới tế bào là những hướng đi mũi nhọn của y học. Một trong những lĩnh vực mũi nhọn ấy là nghiên cứu, tìm hiểu và sử dụng tế bào gốc trong điều trị như việc cấy ghép mô, tế bào vào cơ thể trưởng thành nhằm phục hồi một phần hay toàn bộ chức năng của mô, tế bào sau những thương tổn bệnh lý hay lão hóa, sau những sang chấn cơ học hay do những khuyết tật bẩm sinh.
Những năm gần đây, mặc dù không có số liệu thống kê toàn cầu, nhưng nhu cầu cấy ghép tế bào gốc có xu hướng ngày càng tăng, đặc biệt trong bệnh máu ác tính, các bệnh lý về xương khớp và các bệnh lý về tim mạch… Ngay cả trong các bệnh lý tại hệ thống thần kinh – một loại mô có những tế bào biệt hóa rất cao, tưởng như không thể tự thay mới khi có tổn thương – thì việc nghiên cứu cấy ghép tế bào gốc và liệu pháp gen nhằm thay thế các tế bào thần kinh thoái hóa đang là một hướng đi mang lại nhiều hi vọng mới cho người bệnh.


Ý tưởng cấy ghép tế bào gốc để điều trị bệnh Parkinson – là bệnh lý rối loạn thần kinh thoái hóa tiến triển do giảm chức năng các nơron tiết dopamin trong não đã được bắt đầu từ những năm 1980. Trên thế giới, rất nhiều nghiên cứu trên động vật và trên người đã chỉ ra rằng việc ghép tế bào gốc cải thiện đáng kể triệu chứng của bệnh Parkinson [1], [2]. Nhiều loại tế bào gốc khác nhau được thử nghiệm trên động vật: tế bào gốc tủy xương [3], tế bào gốc cảm ứng (iPS cells) [4], tế bào gốc ngoại bì thần kinh của bào thai (mesencephalic neuroepithelial stem cells = M-NECs). Trong số các loại trên, tế bào gốc ngoại bì thần kinh bào thai người đã được thử nghiệm lâm sàng trên người và đã mang lại kết quả tích cực do các tế bào ở đây có tỷ lệ biệt hóa thành các neuron tiết dopamin sau ghép cao, mô ghép hòa hợp tốt với mô chủ và chưa có bằng chứng nào về việc tiết dopamin bất thường từ các mảnh ghép trên mô chủ.2
Ở Việt Nam hiện nay, tỷ lệ mắc bệnh Parkinson khoảng 1,6% ở những người trên 65 tuổi, và có xu hướng ngày càng tăng với tỷ lệ mắc mới khoảng 20/100 000 dân/năm. Thêm vào đó, điều trị nội khoa bằng cách sử dụng các thuốc là tiền chất chuyển hóa của dopamin như Levodopa cũng chỉ có tác dụng tốt trong khoảng 5-10 năm do hiện tượng kháng thuốc điều trị [5]. Vì vậy, việc nghiên cứu một phương pháp điều trị mới, có khả năng giải quyết được nguyên nhân gây bệnh là vô cùng cần thiết để hạn chế nguy cơ tàn phế do bệnh tật, nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Với mong muốn tiếp cận một phương pháp mới trong điều trị bệnh Parkinson cũng như mong muốn nâng cao chất lượng cuộc sống cho người bệnh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi-thai thành tế bào dạng tiết dopamin” với mục tiêu:
1. Phân lập, tăng sinh, biệt hóa và bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi chuột cống trắng thành tế bào dạng tiết dopamin.
2. Bước đầu phân lập, tăng sinh và biệt hóa được tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi – thai người thành tế bào dạng tiết dopamin

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………………………….. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ……………………………………………………………… 3
1.1. Đặc điểm tế bào gốc thần kinh…………………………………………………….. 3
1.2. Quá trình hình thành và biệt hóa nơron tiết dopamin in vivo ……………. 5
1.3. Tế bào gốc não giữa và nơron tiết dopamin: ứng dụng trong điều trị…… 8
1.4. Phân lập, nuôi cấy và bảo quản lạnh tế bào gốc sàn não giữa phôi ….. 11
1.4.1. Phân lập……………………………………………………………………………. 11
1.4.2. Nuôi cấy tế bào gốc thần kinh ……………………………………………… 17
1.5. Định danh tế bào gốc thần kinh và tế bào tiết dopamin………………….. 25
1.5.1. Định danh tế bào gốc thần kinh ……………………………………………. 25
1.5.2. Định danh tế bào tiết dopamin……………………………………………… 30
1.6. Bảo quản lạnh tế bào gốc thần kinh và nơron tiết dopamin…………….. 33
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 36
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu………………………………………………. 36
2.2. Đối tượng nghiên cứu………………………………………………………………. 36
2.3. Phương pháp nghiên cứu ………………………………………………………….. 36
2.4. Các bước tiến hành………………………………………………………………….. 38
2.4.1. Các bước tiến hành trên phôi chuột ………………………………………. 38
2.4.2. Các bước tiến hành trên phôi người………………………………………. 42
2.5. Chỉ tiêu nghiên cứu …………………………………………………………………. 43
2.6. Trang thiết bị, vật tư hóa chất dùng trong nghiên cứu……………………. 44
2.6.1. Trang thiết bị…………………………………………………………………….. 44
2.6.2. Vật tư tiêu hao…………………………………………………………………… 44
2.6.3. Hóa chất, môi trường………………………………………………………….. 45
2.7. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu……………………………………….. 46
2.7.1. Kỹ thuật hiển vi…………………………………………………………………. 462.7.2. Kỹ thuật siêu vi …………………………………………………………………. 48
2.7.3. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch………………………………………………….. 49
2.7.4. Kỹ thuật đếm tế bào TH ……………………………………………………… 50
2.8. Xử lí số liệu nghiên cứu …………………………………………………………… 52
2.9. Đạo đức nghiên cứu…………………………………………………………………. 52
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ………………………………………….. 53
3.1. Phân lập, tăng sinh và bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh
não giữa phôi chuột……………………………………………………………………….. 53
3.1.1. Phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc ngoại bì thần kinh sàn
não giữa phôi chuột theo nhóm tuổi ………………………………………………. 53
3.1.2. Nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi chuột E12,5 – E13,5 ….. 66
3.1.3. Bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi……………………. 71
3.2. Phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi người 74
3.2.1. Phân lập tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi người…………………… 74
3.2.2. Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc biểu mô ống thần kinh phôi người
tạo nơron tiết dopamin ………………………………………………………………… 77
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN……………………………………………………………….. 83
4.1. Phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc ngoại bì thần kinh não giữa
phôi chuột ……………………………………………………………………………………. 83
4.1.1. Xác định vị trí phẫu tích tế bào gốc ngoại bì thần kinh …………….. 83
4.1.2. Thử nghiệm nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh phân lập từ
sàn não giữa trên phôi chuột từ 10,5 đến 14,5 ngày………………………….. 89
4.1.3. Nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh não giữa phôi chuột cống
trắng giai đoạn E12,5 – E13,5 ………………………………………………………. 93
4.1.4. Bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi……………………. 98
4.2. Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi người……… 101
4.2.1. Thuận lợi và khó khăn trong quá trình thu thập phôi và phân lập
tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi người………………………………………. 1014.2.2. Cấu trúc của biểu mô ống thần kinh phôi người 6,5 – 7,5 tuần tuổi 102
4.2.3. Sự phát triển của các tế bào nuôi cấy và định danh các tế bào sau
nuôi cấy…………………………………………………………………………………… 103
4.3. Hiệu quả nuôi cấy tạo nơron tiết dopamin …………………………………. 106
KẾT LUẬN ………………………………………………………………………………….. 113
KHUYẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP………………………. 115
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Những marker bề mặt tế bào thần kinh nhạy cảm với enzyme … 14
Bảng 3.1. Phân bố phôi chuột theo độ tuổi………………………………………….. 64
Bảng 3.2. Tỷ lệ trích thủ thành công mẫu mô não giữa qua các giai đoạn… 64
Bảng 3.3. Tỷ lệ mọc mẫu theo tuổi phôi …………………………………………….. 66
Bảng 3.4. Tỷ lệ tế bào, cụm tế bào dương tính với marker TH sau nuôi cấy …. 71
Bảng 3.5. Tỷ lệ sống của các tế bào thần kinh sau rã đông ……………………. 72
Bảng 3.6. Đánh giá tỷ lệ sống của tế bào theo thời gian………………………… 72
Bảng 3.7. Sự phân bố tuổi phôi, khả năng phẫu tích, phân lập của các phôi….. 75
Bảng 3.8. Tổng số tế bào sau phân lập và tỷ lệ tế bào sống……………………. 76
Bảng 3.9. Sự phân bố số tế bào dương tính với TH trong giếng nuôi cấy
theo tuổi phôi…………………………………………………………………… 81
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Tổng số tế bào sau phân lập……………………………………………. 65
Biểu đồ 3.2. Tỷ lệ mọc mẫu nuôi cấy sau rã đông………………………………… 73
Biểu đồ 3.3. Sự gia tăng số lượng tế bào dương tính với TH theo ngày
nuôi cấy………………………………………………………………………. 8

Phân lập, tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi-thai thành tế bào dạng tiết dopamin

Leave a Comment