Phân tích mối tương quan giữa đột biến gen ATP7B và kiểu hình trên bệnh nhân Wilson ở Việt Nam

Luận án tiến sĩ y học Phân tích mối tương quan giữa đột biến gen ATP7B và kiểu hình trên bệnh nhân Wilson ở Việt Nam.Y học hiện đại đã có những bước tiến nhanh trong khoảng vài thập kỷ trở lại đây, sau sự kiện các nhà khoa học hoàn tất việc giải mã bộ gen người. Cơ chế bệnh sinh dần dần được sáng tỏ ở mức độ phân tử, làm tiền đề cho việc chẩn đoán và điều trị can thiệp trúng đích nhằm giải quyết tận gốc căn nguyên của bệnh. Năm 1993 Kary Mullis, người phát minh ra kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction: phản ứng khuếch đại chuỗi) được trao giải Nobel về hóa học. Từ đó kỹ thuật PCR được nhanh chóng được phát triển và ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về lĩnh vực sinh học phân tử.

Những tiến bộ của ngành hoá sinh, sinh học phân tử đã giúp sàng lọc, chẩn đoán sớm, phòng bệnh, điều trị tốt hơn các bệnh rối loạn chuyển hóa và di truyền… Mặc dù không phổ biến như một số nhóm bệnh khác nhưng đây là nhóm gây nhiều khó khăn trong điều trị và để lại hậu quả rất nặng nề về sức khỏe, tinh thần cũng như chất lượng cuộc sống cho bệnh nhi, đồng thời trở thành, gánh nặng cho gia đình và toàn thể xã hội.
Luận án tiến sĩ y học Phân tích mối tương quan giữa đột biến gen ATP7B và kiểu hình trên bệnh nhân Wilson ở Việt Nam Bệnh Wilson thuộc nhóm bệnh lý rối loạn chuyển hóa và di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường với tỷ lệ mắc bệnh là 1/30.000 trẻ [1]. Bệnh gây nên do đột biến gen ATP7B, là gen có vai trò điều hòa quá trình chuyển hóa đồng trong cơ thể. Khi đột biến gen xảy ra sẽ gây rối loạn quá trình chuyển hóa đồng, làm cho lượng đồng tăng cao trong cơ thể và tích lũy dần ở các cơ quan (gan, não, mắt…) gây ra các triệu chứng đa dạng trên lâm sàng, các triệu chứng này tiến triển nặng dần cùng với quá trình lắng đọng đồng theo thời gian. Ngoài ra, đồng có thể lắng đọng ở hầu hết các cơ quan khác trong cơ thể nhưng thường biểu hiện nhẹ và muộn hơn. Bệnh nhân Wilson thường biểu hiện triệu chứng vềề gan nhiều hơn triệu chứng về thần kinh ở nhóm dưới 10 tuổi, các triệu chứng thần kinh hay gặp hơn ở bệnh nhân sau 30 tuổi [1].
Hiện nay, để chẩn đoán xác định bệnh cần có sự kết hợp giữa các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình như: nồng độ ceruloplasmin huyết thanh, nồng độ đồng trong nước tiểu 24 giờ, định lượng đồng trong gan hoặc chẩn đoán hình ảnh não và gan.
Trong thực hành lâm sàng, chẩn đoán và điều trị sớm bệnh Wilson đóng vai trò quan trọng vì có thể tránh được các tiến triển nặng của bệnh dẫn đến tử vong. Ngày nay, phát hiện đột biến trên gen ATP7B sẽ giúp chẩn đoán xác định bệnh sớm hơn, phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh nhằm ngăn ngừa và làm giảm tỷ lệ mắc bệnh. Bên cạnh đó, xác định mối tương quan giữa kiểu gen ATP7B với thể lâm sàng của bệnh Wilson sẽ giúp cho tiên lượng bệnh và có phác đồ điều trị chính xác, hiệu quả hơn.Phân tích mối tương quan giữa đột biến gen ATP7B và kiểu hình trên bệnh nhân Wilson ở Việt Nam
Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về xác định đột biến gen ATP7B, xác định mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh Wilson. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về bệnh Wilson trước đây chủ yếu là mô tả về đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng [2],[3],[4]. Trong vài năm gần đây, một số nghiên cứu về phát hiện đột biến trên gen ATP7B đã bắt đầu được triển khai [5],[6],[7],[8]. Tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu nào về phân tích mối tương quan giữa kiểu gen ATP7B và kiểu hình của bệnh Wilson tạo cơ sở cho việc tiên lượng bệnh và đưa ra phác đồ điều trị chính xác, hiệu quả. Do đó đề tài: “Phân tích mối tương quan giữa đột biến gen ATP7B và kiểu hình trên bệnh nhân Wilson ở Việt Nam” được thực hiện với 2 mục tiêu:
1. Mô tả đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân Wilson.
2. Phân tích mối tương quan giữa kiểu gen ATP7B và kiểu hình của bệnh nhân Wilson.

MỤC LỤC Phân tích mối tương quan giữa đột biến gen ATP7B và kiểu hình trên bệnh nhân Wilson ở Việt Nam

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Đặc điểm bệnh Wilson 3
1.1.1. Khái niệm về bệnh Wilson 3
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh Wilson 3
1.1.3. Dịch tễ bệnh Wilson 5
1.1.4. Sinh lý bệnh học bệnh Wilson 5
1.1.5. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh Wilson 7
1.1.6. Chẩn đoán 19
1.1.7. Điều trị 22
1.1.8. Tiên lượng và phòng bệnh 27
1.2. Bệnh học phân tử bệnh Wilson 28
1.2.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen ATP7B 28
1.2.2. Đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson 30
1.2.3. Đặc điểm di truyền của bệnh Wilson 35
1.2.4. Cơ chế bệnh học phân tử của bệnh Wilson 36
1.3. Các kỹ thuật phát hiện đột biến gen ATP7B 38
1.3.1. Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp biến tính 38
1.3.2. Sử dụng enzym cắt giới hạn 39
1.3.3. Kỹ thuật giải trình tự gen 40
1.4. Mối tương quan giữa đột biến gen ATP7B và kiểu hình ở bệnh nhân Wilson 42
1.4.1. Mối tương quan giữa các dạng đột biến và kiểu hình 42
1.4.2. Tương quan giữa một số đột biến điểm trên gen ATP7B và
kiểu hình 44
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47
2.1. Đối tượng nghiên cứu 47
2.2. Địa điểm nghiên cứu 48
2.3. Thời gian nghiên cứu 48
2.4. Phương pháp nghiên cứu 48
2.4.1. Phương pháp nghiên cứu 48
2.4.2. Cỡ mẫu nghiên cứu 49
2.4.3. Các nội dung nghiên cứu 49
2.5. Các bước tiến hành nghiên cứu 50
2.5.1. Hỏi bệnh và khám lâm sàng 50
2.5.2. Xét nghiệm sinh hóa và chẩn đoán hình ảnh 52
2.5.3. Chẩn đoán 52
2.5.4. Quy trình phân tích đột biến gen ATP7B 53
2.6. Xử lý kết quả 56
2.7. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 57
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 58
3.1. Một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng 58
3.1.1. Đặc điểm lâm sàng 58
3.1.2. Triệu chứng cận lâm sàng 61
3.1.3. Thể lâm sàng của bệnh Wilson 65
3.2. Kết quả phân tích gen ATP7B 65
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA 65
3.2.2. Kết quả xác định đột biến gen ATP7B 66
3.2.3 Các dạng đột biến gen ATP7B ở bệnh nhân Wilson 72
3.3. Mối tương quan giữa đột biến gen ATP7B và kiểu hình của
bệnh Wilson 73
3.3.1. Mối tương quan giữa số alen đột biến và kiểu hình ở bệnh nhân Wilson 73
3.3.2. Mối tương quan giữa dạng đột biến và kiểu hình bệnh Wilson 78
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 83
4.1. Một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh Wilson 83
4.1.1. Một số đặc điểm lâm sàng của bệnh Wilson 83
4.1.2. Một số đặc điểm cận lâm sàng của bệnh Wilson 90
4.1.3. Các biến đổi về hình ảnh học 92
4.1.4. Các thể lâm sàng của bệnh 94
4.2. Kết quả phân tích gen ATP7B 95
4.3. Phân tích mối tương quan giữa số alen đột biến trên gen ATP7B và kiểu hình của bệnh nhân Wilson 100
4.3.1. Mối tương quan giữa tuổi khởi phát và số alen đột biến 100
4.3.2. Mối tương quan giữa nồng độ ceruloplasmin huyết thanh và
số alen đột biến 101
4.3.3. Mối tương quan giữa đồng niệu 24 giờ và số alen đột biến 102
4.3.4. Mối tương quan giữa thể lâm sàng và số alen đột biến 103
4.4. Phân tích mối tương quan giữa dạng đột biến trên gen ATP7B và kiểu hình của bệnh nhân Wilson 104
4.4.1. Mối tương quan giữa tuổi khởi phát và dạng đột biến 104
4.4.2. Mối tương quan giữa nồng độ ceruloplasmin huyết thanh và dạng
đột biến 106
4.4.3. Mối tương quan giữa đồng niệu 24 giờ và dạng đột biến 107
4.4.4. Mối tương quan giữa thể lâm sàng và dạng đột biến 108
KẾT LUẬN 119
KHUYẾN NGHỊ 120
DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Chỉ số tiên lượng suy gan tối cấp 26
Bảng 1.2. Kế hoạch ứng dụng lâm sàng của liệu pháp gen 27
Bảng 1.3. Một số dạng đột biến phổ biến trên thế giới 30
Bảng 1.4. Kiểu gen trên bệnh nhân Wilson Trung Quốc 34
Bảng 2.1. Thang điểm chẩn đoán bệnh Wilson theo Ferenci 47
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR 54
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR 55
Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng sequencing 55
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng sequencing 56
Bảng 3.1. Tuổi khởi phát bệnh 58
Bảng 3.2. Triệu chứng ở giai đoạn khởi phát 59
Bảng 3.3. Triệu chứng ở giai đoạn toàn phát 60
Bảng 3.4. Tiền sử gia đình của bệnh nhân Wilson 61
Bảng 3.5. Định lượng ceruloplasmin huyết thanh 61
Bảng 3.6. Định lượng transaminase huyết thanh 62
Bảng 3.7. Xét nghiệm đồng niệu 24 giờ 62
Bảng 3.8. Kết quả siêu âm ổ bụng 63
Bảng 3.9. Kết quả chụp MRI sọ não 64
Bảng 3.10. Phân bố đột biến trên gen ATP7B của bệnh nhân Wilson 67
Bảng 3.11: Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của các bệnh nhân Wilson mang đột biến mới và đột biến đã được công bố gây bệnh trên gen ATP7B 68
Bảng 3.12. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và số alen đột biến 74
Bảng 3.13. Chỉ số tương quan giữa các thể lâm sàng và số alen đột biến 77
Bảng 3.14. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và dạng đột biến 78
Bảng 3.15. Chỉ số tương quan giữa các thể lâm sàng và dạng đột biến 82

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Chu trình chuyển hóa của đồng trong cơ thể 6
Hình 1.2. Hình ảnh vòng Kayser-Fleischer ở rìa giác mạc 9
Hình 1.3. Hình ảnh đục nhân mắt hình hoa hướng dương 10
Hình 1.4: Hình ảnh giảm tỷ trọng trên CT sọ não bệnh nhân nữ 14 tuổi bị bệnh Wilson 15
Hình 1.5. Hình ảnh MRI sọ não của bệnh nhân Wilson 16
Hình 1.6. Hình ảnh chụp PET não của bệnh nhân Wilson 19
Hình 1.7. Cấu trúc protein ATP7B 29
Hình 1.8. Phân bố một số đột biến trên gen ATP7B. 32
Hình 1.9. Phân bố đột biến trên gen ATP7B 33
Hình 1.10. Phả hệ một gia đình bị bệnh di truyền lặn trên NST thường 35
Hình 1.11. Vị trí đột biến trên gen ATP7B 37
Hình 1.12. Nguyên tắc kỹ thuật pDHPLC 39
Hình 1.13. Hình ảnh minh họa xác định đột biến R778W trên gen ATP7B bằng kỹ thuật cắt enzym giới hạn 40
Hình 1.14. Trình tự nucleotid được xác định trên máy giải trình tự gen 41
Hình 1.15. Các dạng đột biến và thể lâm sàng của bệnh Wilson 43
Hình 3.1. Tỷ lệ mắc bệnh theo giới 58
Hình 3.2. Hình ảnh tăng tín hiệu nhân xám đối xứng 2 bên trên phim MRI của bênh nhân mã số W56.00 (mũi tên màu đỏ) 64
Hình 3.3. Các thể lâm sàng của bệnh Wilson 65
Hình 3.4. Hình ảnh sản phẩm PCR đoạn gen ở exon 8 của gen ATP7B. 66
Hình 3.5. Hình giải trình tự gen của bệnh nhân mã W8.00 72
Hình 3.6. Hình giải trình tự gen của bệnh nhân mã W37.00 72
Hình 3.7. Hình giải trình tự gen của bệnh nhân mã W38.00 73
Hình 3.8. Phân bố tuổi khởi phát và số alen đột biến 75
Hình 3.9. Phân bố nồng độ cerulopllasmin huyết thanh và số alen đột biến 75
Hình 3.10. Phân bố nồng độ đồng niệu 24 giờ và số alen đột biến 76
Hình 3.11. Phân bố thể lâm sàng và số alen đột biến 77
Hình 3.12. Phân bố tuổi khởi phát và dạng đột biến 79
Hình 3.13. Phân bố nồng độ ceruloplasmin huyết thanh và dạng đột biến 80
Hình 3.14. Phân bố đồng niệu 24 giờ và dạng đột biến 81
Hình 3.15. Phân bố dạng đột biến và thể lâm sàng của bệnh Wilson 81
Hình 4.1. Hình ảnh bệnh nhân mã số W55.00 111
Hình 4.2. Hình giải trình tự gen của bệnh nhân mã W55.00 112
Hình 4.3. Hình ảnh bệnh nhân W31.00 (A) và hình ảnh MRI sọ não (B) 113
Hình 4.4. Hình giải trình tự gen của bệnh nhân mã W31.00 114
Hình 4.5. Hình ảnh bệnh nhân W58.00 (A) và hình ảnh MRI sọ não (B) 115
Hình 4.6. Hình giải trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số W58.00 116
Hình 4.7. Hình ảnh gia đình bệnh nhân mã số W58.00 118
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Richard K Gilroy (2014). Wilson disease clinical presentation. http://emedicine.medscape.com/article/183456-clinical.showall.
2. Lê Đức Hinh, (1990). Một số đặc điểm bệnh Wilson ở Việt Nam. Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học, Viện bảo vệ sức khỏe trẻ em. 3, 316-334.
3. Lê Đức Hinh (2006). Đặc điểm lâm sàng của bệnh Wilson Việt Nam. Y học Việt Nam. 363, 1-9.
4. Đỗ Thanh Hương, Nguyễn Văn Liệu (2012). Đặc điểm lâm sàng và hình ảnh cộng hưởng từ sọ não của bệnh Wilson. Tạp chí Nhi khoa. 3(5), 26-30.
5. Đỗ Thanh Hương, Nguyễn Văn Liệu, Phan Tuấn Nghĩa và cộng sự (2010). Đột biến gen R778L ở bệnh nhân Wilson Việt Nam. Tạp chí Nhi khoa. 3(3,4), 231-235.
6. Hoàng Lê Phúc, Krsin Zinober, Claudia Willheim và cộng sự (2012). Bước đầu phân tích đột biến phân tử gen ATP7B ở bệnh nhi Wilson Việt Nam. Y học Thành Phố Hồ Chí Minh. 16(4).
7. Thi Mai Huong Nguyen, Ngo Diem Ngoc, Thi Phuong Mai Nguyen, et al (2015). Mutation analysis of 16 Vietnamese Wilson patients. Annals Translational Medicine. 3, 57-58.
8. Phan Tôn Hoàng (2016). Nghiên cứu phát hiện đột biến gen gây bệnh Wilson. Luận án tiến sỹ y học, Trường Đại học Y Hà Nội.
9. Wilson SAK (1912). Progressive lenticular degeneration: a familial nervous disease associated with cirrhosis of the liver. Brain. 34,
295-507.
20. Bùi Quốc Hương, Nguyễn Nhật Thông, và cộng sự (1970). Tám trường hợp bệnh thoái hóa gan – nhân đậu ở Việt Nam. Hội nghị Thần kinh học Mỹ. 25, 1147.
21. Chu Văn Tường, Lê Văn Thiềng và cộng sự (1979). Bệnh Wilson ở trẻ em (qua 2 trường hợp). Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học, Viện bảo vệ sức khỏe trẻ em.
71. Tạ Thành Văn, Hồ Cẩm Tú, Tạ Minh Hiếu và cộng sự (2011). Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson. Tạp chí nghiên cứu Y học. 3.
75. Khuất Hữu Thanh (2005). Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.