Phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước làm tổ bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA
Phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước làm tổ bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA.Cùng với sự phát triển của nền kinh tế xã hội, tỷ lệ vô sinh ngày càng gia tăng và là nỗi lo cho nhiều cặp vợ chồng. Ra đời vào những năm 1970 của thế kỷ trước, có thể nói phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm “in vitro fertilization – IVF” đã trở thành cứu cánh cho nhiều cặp vợ chồng vô sinh mong muốn có đứa con [1]. Vào năm 2010 bác sỹ Robert G.Edwards đã vinh dự trao giải thưởng Nobel về sinh lý và Y khoa cho những cống hiến to lớn và hiệu quả mà phương pháp này mang lại [2]. Phương pháp này đã mang lại niềm vui, niềm hạnh phúc cho bao cặp vợ chồng khắp nơi trên thế giới, tuy nhiên không phải cặp vợ chồng nào cũng may mắn sinh được những đứa con mong muốn bằng phương pháp này. Tỷ lệ thành công của phương pháp này chỉ đạt hơn 35% tùy theo từng quốc gia [3]. Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của phương pháp này như: tuổi bố mẹ, tình trạng sức khỏe, tinh thần tâm lý, chất lượng tinh trùng và trứng…và đặc biệt chất lượng phôi sau khi thụ tinh. Các phôi có thể bất thường nhiễm sắc thể (NST) thường hay NST giới tính đều làm giảm khả năng mang thai sau khi cấy phôi vào buồng tử cung, có thể gây sảy thai hoặc sinh ra những đứa con không khỏe mạnh[4], [5],[6],[7]. Để làm giảm tỷ lệ sinh ra những đứa con không khỏe mạnh và làm tăng tỷ lệ thành công của phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm, thời gian gần đây các nhà khoa học đã áp dụng quy trình sàng lọc phôi “Pre-Implantion Genetic Diagnosis, PGD” còn gọi là “chẩn đoán di truyền trước làm tổ” nhằm có được những phôi tốt nhất cho quá trình chuyển phôi [8],[9],[10].
Cùng với sự phát triển của kỹ thuật chọc hút phôi và ứng dụng những tiến bộ mới nhất của sinh học phân tử vào chẩn đoán, cho đến nay có rất nhiều bệnh lý di truyền và hầu hết các bất thường trên NST, cả các đột biến gen quan trọng gây ung thư đều có thể được sàng lọc bằng kỹ thuật PGD [11],[12],[13],[14-15]. Trong số đó, bệnh hemophilia A (bệnh ưa chảy máu)là loại bệnh có tỷ lệ mắc cao, bệnh cảnh lâm sàng nặng nề và thường gây ra những sang chấn lớn về tâm lý cho gia đình và cho người bệnh. Vì vậy vấn đề đặt ra là chúng ta phải làm sao giúp cho các cặp vợ chồng mang gen bệnh hemophilia A sinh được những đứa con hoàn toàn khỏe mạnh.
Hemophilia A là bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bất thường chức năng của các yếu tố đông máuVIII [16],[17]. Hemophilia A là bệnh di truyền alen lặn trên NST X không có alen trên NST Y, nên người mẹ mang gen bệnh sẽ di truyền cho con trai và biểu hiện bệnh trên lâm sàng [18].Theo thống kê của tổ chức hemophilia A thế giới, hiện nay có khoảng 250.000 bệnh nhân mắc bệnh hemophilia A và chỉ có khoảng 50.000 được điều trị đặc hiệu [19]. Tại Việt Nam, ước tính có khoảng 6000 người bị bệnh hemophilia A và khoảng 30.000 người mang gen bệnh hemophilia A[20]. Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là chảy máu ở bất kỳ nơi nào trên cơ thể, và chảy máu kéo dài: chảy máu khớp, chảy máu trong cơ, chảy máu não, chảy máu trong cổ và ngực… Mức độ biểu hiện trên lâm sàng liên quan trực tiếp nồng độ yếu tố VIII trong huyết tương.
Việc tầm soát trước sinh bệnh hemophilia A là việc làm hết sức quan trọng giúp cho việc sinh ra những đứa trẻ hoàn toàn khỏe mạnh. Việc xác định đột biến gen gây bệnh, sàng lọc người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A đã được nghiên cứu khá nhiều ở Việt Nam.Việc quản lý bệnh nhân và người mang gen của bệnh lý này là tiền đề vững chắc để triển khai thành công quy trình chẩn đoán trước làm tổ trong sàng lọc phôi. Phương pháp này sẽ giúp giảm biến chứng và di chứng cho người mẹ khi mang thai bệnh lý, giảm chấm dứt thai kỳ do phát hiện bệnh ở thai nhi khi chẩn đoán tiền sản, mang lại niềm vui hạnh phúc cho các cặp vợ chồng mang gen bệnh, đồng thời giảm tỷ lệ mắc bệnh ở cộng đồng. Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử phát hiện các đột biến gây bệnh hemophilia A, kỹ thuật microsatellite DNA là kỹ thuật sử dụng các primer gắn huỳnh quang để khuếch đại vùng trình tự lặp lạingắn (short tandem repeat-STR) và phân tích kích thước của chúng thông qua điện di mao quản trên máy giải trình tự gen để xác định các alen đột biến. Kỹ thuật này có nhiều ưu điểm là dễ dàng phát hiện alen đột biến mà không cần xác định các đột biến trực tiếp, vì vậy sẽ giảm được chi phí cho gia đình bệnh nhân. Hiện naykỹ thuật này còn khá mới mẻ ở Việt Nam ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh lý di truyền. Xuất phát từ thực tế đó đề tài: “Phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước làm tổ bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA” được đưa vào nghiên cứu với mục tiêu:
1. Xác định người lành mang gen bệnh hemophilia A bằngkỹ thuật microsatellite DNA.
2. Chẩn đoán trước làm tổ cho những người mẹ mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA.
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG BỆNH HEMOPHILIA A 4
1.1.1. Định nghĩa 4
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu 4
1.1.3. Dịch tễ bệnh học 4
1.1.4. Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán bệnh hemophilia A 5
1.2. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ CƠ SỞ PHÂN TỬ HEMOPHILIA A 8
1.2.1. Cơ chế di truyền bệnh hemophilia A 8
1.2.2. Cơ sở phân tử học bệnh hemophilia A 9
1.3. NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A 14
1.3.1. Đặc điểm chung người mang gen bệnh 14
1.3.2. Cơ chế di truyền của người mang gen bệnh hemophilia A 14
1.3.3. Triệu chứng của người mang gen 16
1.3.4. Các phương pháp phát hiện người lành mang gen bệnh 17
1.4. PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM VÀ QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ 23
1.4.1. Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm 23
1.4.2. Quy trình chẩn đoán gen trước làm tổ 25
1.4.3. Các phương pháp và kỹ thuật sinh học phân tử mới nhất áp dụng trong việc chẩn đoán trước làm tổ 30
1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI VỀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ 38
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam 38
1.5.2. Tình hình nghiên cứu chẩn đoán trước làm tổ bệnh hemophilia A 42
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 46
2.2. DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 47
2.2.1. Dụng cụ và trang thiết bị 47
2.2.2. Hoá chất 48
2.2.3. Trình tự mồi cho phản ứng 51
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu 52
2.3.2. Địa điểm nghiên cứu 54
2.3.3. Quy trình và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 54
2.3.4. Quy trình xác định người lành mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA 57
2.3.5. Quy trình chẩn đoán trước làm tổ 60
2.4. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU TRONG Y HỌC 63
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 64
3.1. KẾT QUẢ PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN F8 BỊ ĐỘT BIẾN BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA 64
3.1.1. Kết quả xác định marker dị hợp tử gen F8 trên bệnh nhân và người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật microsatellite DNA 64
3.1.2. Kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA 68
3.2. KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ BỆNH HEMOPHILIA BẰNG KỸ THUẬT MICROSATTELITE DNA 90
3.2.1. Kết quả kích thích buồng trứng và thực hiện ICSI 90
3.2.2. Kết quả chẩn đoán tiền làm tổ của các gia đình hemophilia A 92
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 108
KẾT LUẬN 138
KHUYẾN NGHỊ 139
CÁC DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần hóa chất sử dụng cho điện di mao quản 63
Bảng 3.1. So sánh kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh bằng 2 phương pháp 87
Bảng 3.2. Tỷ lệ phát hiện người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật microsatellite-DNA 88
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá về tỷ lệ phôi phát triển sau khi thụ tinh 90
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá sự phát triển của các phôi thu được ngày 3 91
Bảng 3.5. Kết quả sinh thiết phôi chẩn đoán gen và đánh giá sự phát triển phôi sau sinh thiết 3 ngày 92
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh chảy máu khớp gối ở bệnh nhân hemophilia A 5
Hình 1.2. Hình ảnh chảy máu trong cơ ở bệnh nhân hemophilia A 6
Hình 1.3. Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ và thế hệ sau 8
Hình 1.4. Vai trò của yếu tố VIII trong quá trình đông máu huyết tương 10
Hình 1.5. Vị trí của gen mã hóa yếu tố VIII trên NST X 10
Hình 1.6. Cấu trúc gen và protein FVIII 11
Hình 1.7. Protein yếu tố VIII với các vùng chức năng 12
Hình 1.8. Sơ đồ di truyền của người mẹ mang gen kết hôn với bố bình thường 15
Hình 1.9. Sơ đồ di truyền của người mẹ bình thường kết hôn với bố bị bệnh 15
Hình 1.10. Sơ đồ phả hệ của người mẹ mang gen kết hôn với bố bình thường 18
Hình 1.11. Sơ đồ di truyền của người mẹ mang gen kết hôn với bố bị bệnh 19
Hình 1.12. Quy trình thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm 25
Hình 1.13. Sinh thiết phôi bào giai đoạn blastomere cho chẩn đoán PGD 28
Hình 1.14. Ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đoán xác định giới tính và số lượng nhiễm sắc thể 32
Hình 1.15. Kết quả multiplex PCR sử dụng cặp mồi amel, SYR, FXS1108, DXS 9798, trên phôi bào sinh thiết chẩn đoán bệnh hemophilia A 37
Hình 1.16. Sơ đồ phả hệ của một gia đình mang gen đột biến đảo đoạn intron 22 gây bệnh hemophilia A 43
Hình 1.17. Hình ảnh các marker dị hợp tử xác định đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A 44
Hình 1.18. Kết quả multiplex PCR sử dụng cặp mồi amel, SYR, FXS1108, DXS 9798, trên phôi bào sinh thiết 45
Hình 2.1. Kết quả STR lựa chọn marker dị hợp tử 59
Hình 2.2. Kỹ thuật Microsatellite DNA trong chẩn đoán đột biến gen gây bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X 59
Hình 2.3. Kết quả STR xác định giới tính 62
Hình 3.1. Kết quả đồng hợp tử và đồng hợp tử của STR 64
Hình 3.2. Kết quả khuếch đại các marker DXS9901, FXS1108, F8int22 và DXS9897 65
Hình 3.3. Tần suất alen của marker FXS 1108 66
Hình 3.4. Tần suất alen của marker DXS9897 66
Hình 3.5. Tần suất alen của marker F8int22 67
Hình 3.6. Tần suất alen của marker DXS9901 67
Hình 3.7. Sơ đồ phả hệ gia đình HA 61 68
Hình 3.8. Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình mã số HA61 69
Hình 3.9. Hình ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồiFXS1108, DXS9897 và F8int22 của gia đình HA61 70
Hình 3.10. Sơ đồ phả hệ gia đình HA37 sau khi phân tích bằng hai phương pháp 72
Hình 3.11. Ảnh giải trình tự gen của gia đình mã số HA37 73
Hình 3.12. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS9901 và DXS9897 của gia đình mã số HA37 74
Hình 3.13. Sơ đồ phả hệ gia đình HA50 sau khi phân tích bằng hai
phương pháp 75
Hình 3.14. Hình ảnh giải trình tự gen gia đình HA50 76
Hình 3.15. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS9901, DXS9897 và FXS1108, của gia đình bệnh nhân hemophilia A mã số HA50 77
Hình 3.16. Sơ đồ phả hệ gia đình HA16 79
Hình 3.17. Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình mã số HA16 80
Hình 3.18. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS9901 và DXS9897 của gia đình HA16 81
Hình 3.19. Sơ đồ phả hệ gia đình HA30 sau khi phân tích 83
Hình 3.20. Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số HA30 84
Hình 3.21. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS9901 vàFXS1108, của gia đình bệnh nhân hemophilia A mã số HA30 85
Hình 3.22. Ảnhđiện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi, F8in22, DXS9897 và DXS9901 của gia đình mã số HA09 89
Hình 3.23. Kết quả khuếch đại các marker FXS1108, F8int22, và DXS9897 94
Hình 3.24. Kết quả multiplex PCR khuếch đại 3 marker dị hợp tử FXS1108, DXS9897 và F8int22 và 2 marker giới tính Amel và SRY trên mẫu bệnh nhân HA61 95
Hình 3.25. Ảnhđiện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS 1108, F8int22, DXS 9897 xác định phôi nam bình thường của gia đình HA61 96
Hình 3.26. Ảnhđiện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS 1108, F8int22, DXS 9897 xác định phôi nam bệnh lý gia đình HA61 97
Hình 3.27. Sơ đồ phả hệ phôi gia đình HA61 98
Hình 3.28. Kết quả khuếch đại các marker FXS1108 và DXS9897 99
Hình 3.29. Ảnhđiện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồiFXS1108 và DXS9897 của người mẹ so sánh với bệnh nhân HA28 100
Hình 3.30. Ảnhđiện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS 1108, DXS 9897 xác định phôi nam bình thường gia đình HA28 102
Hình 3.31. Ảnhđiện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS 1108, DXS 9897 xác định phôi nam bệnh lý gia đình HA28 103
Hình 3.32. Ảnhđiện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS 1108, DXS 9897 xác định phôi nữ mang gen gia đình HA28 104
Hình 3.33. Ảnhđiện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS 1108, DXS 9897 xác định phôi nữ không mang gen gia đình HA28 105
Hình 3.34. Sơ đồ phả hệ gia đình HA28 106
Hình 3.35. Tỷ lệ phôi bất thường và không bất thường về gen 107
CÁC DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Bùi Thị Minh Phượng, Trần Quốc Đạt, Bùi Thị Thu Hương, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn, Trần Vân Khánh (2017). Xác định người lành mang gen trên các thành viên nữ của gia đình bệnh nhân hemophiliaA bằng kỹ thuật microsatellite DNA, Y học Việt Nam, tập 458, tháng 9 số đặc biệt, tr. 169-175.
2. Bùi Thị Minh Phượng, Trần Huy Thịnh, Nguyễn Viết Tiến, Tạ Thành Văn, Trần Vân Khánh (2018). Áp dụng kỹ thuật microsatellite DNA trong chẩn đoán trước làm tổ bệnh hemophilia A, Y học Việt Nam, tập 470, tháng 9, số chuyên đề, tr. 100-108.