SÀNG LỌC IN SILICO VÀ IN VITRO CÁC CẤU TRÚC PHÂN TỬ NHỎ CÓ KHẢ NĂNG TƯƠNG TÁC VỚI INTERLEUKIN-33 VÀ THỤ THỂ ST2

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC SÀNG LỌC IN SILICO VÀ IN VITRO CÁC CẤU TRÚC PHÂN TỬ NHỎ CÓ KHẢ NĂNG TƯƠNG TÁC VỚI INTERLEUKIN-33 VÀ THỤ THỂ ST2.  Interleukin (IL)-33 được phát hiện từ năm 2003 và là thành viên thứ 11 của họ cytokin IL-1. IL-33 đóng vai trò quan trọng trong sự cân bằng và sửa chữa nội mô, tham gia vào các phản ứng miễn dịch loại 2, quá trình viêm, dị ứng, nhiễm trùng và ung thư. Được giải phóng khi có sự tổn thương mô hoặc tế bào, IL-33 hoạt động bằng cách gắn kết với thụ thể ức chế khối u 2 (suppression of tumorigencity 2 – ST2) biểu hiện trên bề mặt các tế bào đích, đặc biệt là các tế bào miễn dịch. Sự gắn kết giữa IL- 33 và ST2 là một tương tác protein-protein (PPI). Phức hợp IL-33/ST2 tiếp tục liên kết với đồng thụ thể IL-1RAcP để kích hoạt đường truyền tín hiệu phụ thuộc protein đáp trả sơ cấp với sự biệt hóa tế bào dòng tủy 88 (Myeloid differentiation primary response 88 − MyD88) bên trong tế bào đích và gây ra các đáp ứng sinh học.1

Trong 20 năm được nghiên cứu, sự đóng góp của IL-33 vào cơ chế sinh bệnh học của các bệnh lý viêm như hen suyễn, bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (COPD), viêm khớp và viêm ruột đã được chứng minh.2-4 Bên cạnh đó, protein này còn có liên quan đến các bệnh tự miễn như viêm khớp dạng thấp, viêm ruột tự miễn, lupus ban đỏ và xơ cứng bì hệ thống;5,6 các bệnh lý thần kinh trung ương như bệnh Alzheimer và đa xơ cứng.7,8 Con đường IL-33/ST2 cũng liên quan đến nhồi máu cơ tim, suy tim và bệnh mảnh ghép chống chủ.9-11 Mối liên quan của IL-33/ST2 đến những bệnh lý kể trên đã được chứng minh qua các thử nghiệm lâm sàng hoặc trên mô hình chuột loại bỏ gen. Từ đó, IL-33 và thụ thể ST2 không chỉ trở thành các dấu ấn sinh học dùng trong chẩn đoán và theo dõi các bệnh viêm và tự miễn,12 mà còn được xem là mục tiêu tác động tiềm năng để phát triển các thuốc điều trị những bệnh lý liên quan. Thống kê năm 2019 của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cho thấy hen suyễn ảnh hưởng đến 262 triệu người và gây ra 455.000 ca tử vong, trong khi COPD là nguyên nhân gây tử vong hàng thứ 3 trên thế giới với 3,23 triệu ca. Mặc dù ít gặp hơn, nhưng các bệnh tự miễn như viêm khớp dạng thấp gây ảnh hưởng đến 18 triệu người và lupus ban đỏ hệ thống có tỉ lệ lưu hành lên đến 3,4 triệu ca.13,14 Với những gánh nặng y tế như vậy, việc tìm kiếm các tác nhân trị liệu mới và hiệu quả hơn cho các bệnh lý này là cần thiết. Ức chế hoạt tính cytokin của IL-33 là một trong những hướng nghiên cứu tiềm năng, mở ra cơ hội điều trị các bệnh viêm và tự miễn với một cơ chế mới.
Trong những năm gần đây, IL-33 và ST2 đã trở thành các protein mục tiêu hấp dẫn và được quan tâm nghiên cứu. Hiện nay, các ứng viên được đưa vào thử nghiệm lâm sàng đều là những tác nhân sinh học, gồm kháng thể đơn dòng trung hòa IL-33 như torudokimab, itepekimab, tozorakimab và kháng thể kháng ST2 như astegolimab, melrilimab.15-19 Mặc dù thể hiện ái lực cao với IL-33/ST2, kháng thể đơn dòng vẫn là những liệu pháp đắt tiền, phải sử dụng bằng đường tiêm, yêu cầu đặc biệt về điều kiện bảo quản và các phản ứng phụ trên miễn dịch. Ngược lại, thuốc phân tử nhỏ có các ưu điểm về sinh khả dụng đường uống, tính chất dược động học dễ điều chỉnh, dễ phân liều và bảo quản. Các tác nhân này có thể tổng hợp lượng lớn và từ đó góp phần giảm chi phí điều trị. Mặc dù một số hợp chất phân tử nhỏ ức chế IL-33 và ST2 đã được báo cáo,20-24 việc tìm kiếm các hợp chất mới gắn kết ái lực cao và chọn lọc với các mục tiêu này vẫn là một nhu cầu cấp thiết.
Là những mục tiêu PPI, IL-33 và ST2 liên kết với nhau tại những bề mặt nông và rộng, đặt ra các thách thức cho quá trình tìm kiếm chất ức chế phân tử nhỏ. Khám phá thuốc mới là một quá trình tiêu tốn nhiều thời gian và chi phí, đặc biệt với những mục tiêu khó khăn như PPI. Với sự phát triển của khoa học máy tính, quá trình này đã được thúc đẩy một cách mạnh mẽ. Dù vậy, các nghiên cứu in silico trên IL-33/ST2 vẫn còn hạn chế, chủ yếu là những nghiên cứu sàng lọc ảo sử dụng phương pháp gắn kết phân tử vào các vị trí giả định trên IL-33 của Kim và cộng sự (2016), Adamu và cộng sự (2021), Le và cộng sự (2023) và trên ST2 của Ramadan và cộng sự (2018).20,22,25,26 Cho đến nay, vẫn chưa có nghiên cứu sàng lọc ảo nào được thực hiện dựa trên sự đánh giá toàn diện các vị trí gắn kết trên IL-33 và ST2. Bên cạnh đó, mặc dù một số phân tử nhỏ ức chế IL-33/ST2 đã được báo cáo, vẫn chưa có một công bố nào về các mô hình in silico dựa trên phối tử. Nhằm đóng góp những tiến bộ mới trong lĩnh vực này, đề tài được thực hiện với mục tiêu sàng lọc in silico và in vitro các cấu trúc phân tử nhỏ có khả năng tương tác với IL-33 và thụ thể ST2. Trong đó, việc tìm kiếm chất ức chế được thực hiện theo cả hướng dựa trên cấu trúc mục tiêu lẫn dựa trên phối tử. Cụ thể, các nội dung nghiên cứu sau đây được thực hiện:
1. Xây dựng cơ sở dữ liệu cấu trúc hóa học định hướng cho nghiên cứu sàng lọc in silico chất ức chế PPI
2. Khảo sát tương tác protein-protein của IL-33/ST2 và xác định các vị trí gắn kết cho phối tử phân tử nhỏ trên mỗi protein bằng các công cụ máy tính
3. Xây dựng các mô hình sàng lọc in silico dựa trên cấu trúc mục tiêu IL-33 vàST2, bao gồm mô hình pharmacophore, gắn kết phân tử, mô phỏng động lực học phân tử và tính toán năng lượng tự do gắn kết
4. Xây dựng các mô hình in silico dựa trên các phối tử đã biết của IL-33 và ST2, bao gồm truy vấn tương đồng hình dạng phân tử 3 chiều, mô hình pharmacophore và mô hình mối liên quan định lượng giữa cấu trúc và tác động (QSAR)
5. Thử nghiệm in vitro đánh giá hoạt tính ức chế tín hiệu IL-33/ST2 của các chất được sàng lọc từ nghiên cứu in silico
MỤC LỤC……………………………………………………………………………………………………. i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ……………………………………………………………….. iii
DANH MỤC CÁC BẢNG……………………………………………………………………………. ix
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH………………………………………………..x
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………………………………………….1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ………………………………………………………..3
1.1. Tổng quan về interleukin-33 và thụ thể ST2…………………………………………3
1.2. Các phương pháp in silico trong khám phá thuốc phân tử nhỏ………………18
1.3. Các phương pháp in vitro đánh giá tác động ức chế hoạt tính của IL-33/ST2
……………………………………………………………………………………………………..31
1.4. Tình hình nghiên cứu chất ức chế IL-33 và ST2………………………………….33
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………..40
2.1. Thiết kế nghiên cứu…………………………………………………………………………40
2.2. Đối tượng nghiên cứu………………………………………………………………………40
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu……………………………………………………..43
2.4. Phương pháp và công cụ đo lường, thu thập số liệu …………………………….44
2.5. Quy trình nghiên cứu……………………………………………………………………….61
2.6. Phương pháp phân tích dữ liệu………………………………………………………….63
2.7. Đạo đức trong nghiên cứu ………………………………………………………………..63
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ……………………………………………………………………………64
3.1. Cơ sở dữ liệu cấu trúc hóa học định hướng cho nghiên cứu sàng lọc in silico
chất ức chế PPI…………………………………………………………………………………………64
3.2. Khảo sát tương tác protein-protein của IL-33/ST2 và xác định các vị trí gắn
kết cho phối tử phân tử nhỏ trên mỗi protein bằng các công cụ máy tính…………64
3.3. Mô hình sàng lọc in silico dựa trên cấu trúc mục tiêu IL-33 và ST2………79
3.4. Mô hình in silico dựa trên phối tử ức chế IL-33 và ST2……………………….99
3.5. Thử nghiệm in vitro đánh giá hoạt tính ức chế IL-33/ST2 ………………….107
ii
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ……………………………………………………………………….115
4.1. Cơ sở dữ liệu cấu trúc hóa học định hướng cho nghiên cứu sàng lọc in silico
chất ức chế PPI……………………………………………………………………………………….115
4.2. Khảo sát PPI của IL-33/ST2 và xác định các vị trí gắn kết cho phối tử phân
tử nhỏ trên mỗi protein bằng các công cụ máy tính……………………………………..116
4.3. Mô hình sàng lọc in silico dựa trên cấu trúc mục tiêu IL-33 và ST2…….130
4.4. Mô hình in silico dựa trên phối tử ức chế IL-33/ST2 …………………………136
4.5. Thử nghiệm in vitro đánh giá hoạt tính ức chế IL-33/ST2 ………………….140
NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA ĐỀ TÀI……………………………………………………………..148
KẾT LUẬN……………………………………………………………………………………………….149
KIẾN NGHỊ ………………………………………………………………………………………………151

 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH
Hình 1.1. Các thành phần cấu trúc gen mã hóa và protein của IL-33 ……………………6
Hình 1.2. Tác động cytokin của IL-33 ……………………………………………………………..7
Hình 1.3. Cấu trúc không gian ba chiều của các dạng IL-33 ……………………………….9
Hình 1.4. Cấu trúc của thụ thể ST2 ………………………………………………………………..10
Hình 1.5. Sự tương tác của IL-33 với các thụ thể để thể hiện hoạt tính cytokin……12
Hình 1.6. Mô hình pharmacophore trong thiết kế thuốc với sự trợ giúp của máy tính
…………………………………………………………………………………………………………………..19
Hình 1.7. Một ví dụ về truy vấn ROCS…………………………………………………………..22
Hình 1.8. Nguyên tắc cơ bản của mô phỏng gắn kết phân tử……………………………..25
Hình 1.9. Nguyên tắc cơ bản của mô phỏng động lực học phân tử …………………….27
Hình 1.10. Chu kỳ nhiệt động trong tính toán năng lượng tự do gắn kết của phức hợp
protein–phối tử …………………………………………………………………………………………….30
Hình 1.11. Một số phân tử nhỏ có khả năng gắn kết và ức chế IL-33/ST2 ………….36
Hình 2.1. Hướng tiếp cận sàng lọc in silico chất ức chế tương tác IL-33/ST2 ……..40
Hình 2.2. Khung cấu trúc của các hợp chất đã được báo cáo có tác động ức chế IL-
33/ST2 được sử dụng cho xây dựng mô hình in silico dựa trên phối tử……………….41
Hình 2.3. Hai phương pháp xây dựng mô hình pharmacophore dựa trên PPI………49
Hình 2.4. Quy trình xây dựng truy vấn ROCS và ứng dụng trong sàng lọc ảo …….52
Hình 2.5. Quy trình xây dựng, đánh giá và ứng dụng mô hình pharmacophore dựa
trên phối tử ức chế hoạt tính IL-33/ST2…………………………………………………………..53
Hình 2.6. Quy trình xây dựng mô hình QSAR dự đoán chất ức chế IL-33/ST2……55
Hình 2.7. Quy trình thực hiện thử nghiệm đánh giá hoạt tính ức chế IL-33/ST2 trên
dòng tế bào HEK-Blue IL-33…………………………………………………………………………58
Hình 2.8. Quy trình nghiên cứu tìm kiếm chất ức chế tương tác IL-33/ST2 ………..62
Hình 3.1. Sự đóng góp của các acid amin điểm nóng trong PPI IL-33/ST2 được tính
toán từ quá trình phân rã năng lượng tự do gắn kết MM-GBSA dựa trên mô phỏng
MD …………………………………………………………………………………………………………….68
Hình 3.2. Kết quả đồng thuận từ quá trình quét alanin trên cấu trúc IL-33 và ST2 sử
dụng các máy chủ DrugScorePPI, BUDE Alanine Scan, MutaBind2 và PIIMS …….69
xi
Hình 3.3. Phức hợp của các cytokin họ IL-1 với thụ thể của chúng và sự minh họa
của các vị trí gắn kết thực nghiệm của phối tử phân tử nhỏ trên các cytokin này….71
Hình 3.4. Các vị trí gắn kết tiềm năng trên IL-33 được xác định bởi mô phỏng
MixMD……………………………………………………………………………………………………….73
Hình 3.5. Kết quả mô phỏng MD thời gian dài 5 μs cho phức hợp IL-33 và hợp chất
7c ……………………………………………………………………………………………………………….76
Hình 3.6. Xác định vị trí gắn kết trên thụ thể ST2 với mô phỏng MixMD và NoMA
…………………………………………………………………………………………………………………..78
Hình 3.7. Mô hình gắn kết phân tử cho IL-33 tại hai vị trí của PPI với thụ thể ST2
…………………………………………………………………………………………………………………..79
Hình 3.8. Các mô hình mô phỏng gắn kết phân tử trên ST2………………………………81
Hình 3.9. Các mô hình pharmacophore cho chất gắn kết IL-33 tại vị trí 1…………..82
Hình 3.10. Kết quả mô phỏng gắn kết phân tử của các chất thỏa mãn các mô hình
pharmacophore trên vị trí 1 tại bề mặt PPI của IL-33………………………………………..83
Hình 3.11. Sự tương tác của DB00158 và DB00642 với IL-33 trong mô phỏng MD
50 ns …………………………………………………………………………………………………………..85
Hình 3.12. Các mô hình pharmacophore cho sàng lọc chất ức chế ST2 tại vị trí 1 .86
Hình 3.13. Năng lượng tự do gắn kết MM-GBSA giữa ST2 và các phối tử được khảo
sát. ……………………………………………………………………………………………………………..87
Hình 3.14. Phân tích quỹ đạo mô phỏng MD 100 ns và tính toán năng lượng tự do
gắn kết của 4 hợp chất tiềm năng trên ST2………………………………………………………88
Hình 3.15. Tần suất hình thành tương tác giữa ST2 và 4 phối tử được khảo sát…..89
Hình 3.16. Mô hình pharmacophore PH4-IL33-S2-1 tìm kiếm chất ức chế IL-33 tại
vị trí 2 …………………………………………………………………………………………………………90
Hình 3.17. Các hợp chất dẫn đầu thu được từ quá trình sàng lọc ảo chất ức chế IL-33
tại vị trí 2 của PPI dựa trên mô hình pharmacophore PH4-IL33-S2-M1………………92
Hình 3.18. Phân tích quỹ đạo mô phỏng MD 100 ns và tính toán năng lượng tự do
gắn kết MM-GBSA của các chất tiềm năng được sàng lọc từ mô hình PH4-IL33-S2-
M1. …………………………………………………………………………………………………………….94
Hình 3.19. Mô hình pharmacophore dựa trên cấu trúc phức hợp IL-33/7c ………….95
Hình 3.20. Các hợp chất dẫn đầu thu được từ quá trình sàng lọc ảo chất ức chế IL-33
tại vị trí 2 của PPI dựa trên mô hình pharmacophore PH4-IL33-S2-M2………………97
xii
Hình 3.21. Phân tích quỹ đạo mô phỏng MD 100 ns và tính toán năng lượng tự do
gắn kết MM-GBSA của các chất tiềm năng được sàng lọc từ mô hình PH4-IL33-S2-
M2. …………………………………………………………………………………………………………….98
Hình 3.22. Các truy vấn ROCS cho chất ức chế IL-33 được tạo từ cấu trúc của hợp
chất 7c ………………………………………………………………………………………………………100
Hình 3.23. Các hợp chất dẫn đầu thu được từ quá trình sàng lọc ảo chất ức chế IL-33
tại vị trí 2 của PPI dựa trên mô hình tương đồng hình dạng 3D ROCS-iIL33-6….102
Hình 3.24. Phân tích quỹ đạo mô phỏng MD 100 ns và tính toán năng lượng tự do
gắn kết MM-GBSA của các chất tiềm năng được sàng lọc từ mô hình ROCS-iIL33-
6……………………………………………………………………………………………………………….103
Hình 3.25. Mô hình pharmacophore PH4-LB-iST2 dựa trên phối tử ức chế ST2 được
đánh giá bằng các tập mồi nhử khác nhau và tập không hoạt tính thực nghiệm ….105
Hình 3.26. Sự phân bố điểm số gắn kết của các hợp chất trong thư viện nội bộ với
IL-33 và ST2 tại các vị trí trong mô phỏng gắn kết phân tử với Autodock Vina…108
Hình 3.27. Đánh giá mô hình thử nghiệm in vitro khảo sát tác động ức chế tín hiệu
IL-33/ST2 trên dòng tế bào HEK-Blue IL-33…………………………………………………110
Hình 3.28. Tác động ức chế tín hiệu IL-33/ST2 trên tế bào HB của các hoạt chất hóa
dược và dẫn chất morpholinalkoxychalcon từ thư viện hợp chất nội bộ…………….111
Hình 3.29. Tác động ức chế tín hiệu IL-33/ST2 trên tế bào HB một số dẫn chất
quercetin……………………………………………………………………………………………………112
Hình 3.30. Tỉ lệ sống của tế bào HB khi được xử lý với các hợp chất ở nồng độ 100
μM trong thử nghiệm MTT (các mẫu chứng: môi trường (MT), H2O2 5mM, DMSO
0,2%) ………………………………………………………………………………………………………..113
Hình 3.31. Sự hình thành phức hợp giữa hợp chất T821 và IL-33 được xác định bởi
cơ chế tắt quang tĩnh trong thử nghiệm sử dụng quang phổ huỳnh quang ………….114
Hình 4.1. Quá trình xác định acid amin điểm nóng của PPI bằng các công cụ máy
tính……………………………………………………………………………………………………………117
Hình 4.2. Sự dự đoán túi ẩn tại vị trí 2 của IL-33 từ mô phỏng MD dài với phối tử
thực nghiệm 7c, mô phỏng MixMD và PocketMiner ………………………………………126
Hình 4.3. Các dẫn chất folat cung cấp kiểu cấu trúc tiềm năng có thể gắn kết với các
acid amin điểm nóng mang tính acid của IL-33 tại vị trí 1 của giao diện PPI……..132
xiii
Hình 4.4. Cấu trúc của các chất ức chế ST2 thực nghiệm (iST2-1, iST2-1a và 32) và
các chất gắn kết tiềm năng được sàng lọc từ đề tài (ZINC08911140 và
ZINC40658091) …………………………………………………………………………………………133
Hình 4.5. So sánh kết quả sàng lọc ảo của các mô hình pharmacophore PH4-IL33-
S2-M1, PH4-IL33-S2-M2 và truy vấn tương đồng hình dạng 3 chiều ROCS-iIL33-6
…………………………………………………………………………………………………………………136
Hình 4.6. Sự diễn giải cơ học đối với mô hình QSAR-HB………………………………139
Hình 4.7. Cấu trúc hóa học, dự đoán in silico và hoạt tính in vitro ức chế tín hiệu IL-
33/ST2 trên dòng tế bào HB của một số dẫn chất quercetin……………………………..144
Hình 4.8. Các hợp chất không thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm trên tế bào HB
…………………………………………………………………………………………………………………14