Xác định trình tự gen E6 và L1 của HPV và gen EBNA-1 của EBV để ứng dụng trong chuẩn đoán ung thư cổ tử cung và vòm mũi họng
Luận văn Xác định trình tự gen E6 và L1 của HPV và gen EBNA-1 của EBV để ứng dụng trong chuẩn đoán ung thư cổ tử cung và vòm mũi họng.Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, ung thư (cancer) là một trong những nguyên nhân gây tỷ lệ tử vong cao nhất ở người, chiếm khoảng 12% trong tổng số trường hợp tử vong hàng năm trên thế giới, đứng thứ 2 sau tỷ lệ tử vong của các bệnh lí về tim – mạch và ngày càng có xu hướng gia tăng.
Bệnh ung thư nếu không được phát hiện sớm và điều trị kịp thời sẽ dẫn đến nguyên nhân gây tử vong, do chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu. Bệnh có the xảy ra ở mọi lứa tuổi, ở cả hai giới (nam và nữ) và ở tất cả các mô, các cơ quan trong cơ thể. Đặc biệt, ung thư cổ tử cung (CTC) và ung thư vòm mũi họng (VMH) là hai trong số 5 loại ung thư có tỷ lệ tử vong cao nhất ở Việt Nam và các quốc gia đang phát triển trong khu vực. Trong đó, ung thư CTC đứng thứ 2 trong số các ung thư và là nguyên nhân gây tử vong cao nhất cho phụ nữ ở Việt Nam [1], [9]. Bên cạnh đó, ung thư VMH cũng là một trong 5 loại ung thư phổ biến nhất ở người và là loại hay gặp nhất trong ung thư vùng tai mũi họng ở các nước vùng Đông nam Á và phía nam Trung Quốc [23], [56].
Nguyên nhân gây ra ung thư rất phức tạp, liên quan đến thể địa, tập quán, thói quen và môi trường sống. Trong đó, một số yếu tố đã được coi là liên quan chặt chẽ với việc gây ra ung thư như: yếu tố vật lí (phóng xạ), hóa chất độc, các gốc tự do và đặc biệt ngày nay đã phát hiện ra vai trò của các virus trong tiến triển ung thư. Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh virus là nguyên nhân gây ra hai loại ung thư này ở người. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện sự hiện diện của HPV (Human papilloma virus) trong hơn 95% các trường hợp ung thư cổ tử cung [62], do đó HPV được coi là nguyên nhân gây bệnh ung thư CTC [9]. Các nghiên cứu về mối liên quan giữa Epstein-Barr Virus (EBV) và ung thư VMH cũng đã cho thấy sự biểu hiện của kháng nguyên virus trong các giai đoạn của bệnh, vai trò quan trọng của EBV trong bệnh học cũng như trong quá trình sàng lọc chẩn đoán điều trị, theo dõi và tiên lượng bệnh [24].
Papilloma virus (PV) thuộc họ Papillomaviridae, lưu hành phổ biến trong tự nhiên, gây bệnh chủ yếu cho các loài động vật có xương sống bậc cao như: người, ngựa, bò, chó, thỏ và một số loài chim. Đặc biệt, PV có đặc tính gây bệnh đặc hiệu loài, HPV chỉ gây bệnh ở người mà không gây bệnh ở loài khác [36]. Đối với người, HPV thích ứng gây khối u ở da, miệng, thực quản, hầu, họng và đường hậu môn – sinh dục. Cấu trúc hệ gen HPV là phân tử DNA sợi đôi (double strand DNA – dsDNA) hình vòng tròn khép kín, có độ dài khoảng 7900 cặp nucleotid, được bao bọc bởi phân tử protein histon, các vùng gen HPV được định vị trên một sợi DNA. Trong đó, L1 là gen mã hoá cho protein vỏ ngoài và cũng chính là thành phần kháng nguyên bề mặt của virus. Gen E6 thuộc phân vùng gen thứ 2 (vùng sao chép sớm) của hệ gen HPV, tổng hợp protein E6 và các protein tương ứng, có vai trò quan trọng giúp cho sự nhân lên DNA của virus, tham gia cơ chế hình thành ung thư CTC. Protein E6 của HPV xâm nhập hệ gen của tế bào, phong toả và kìm hãm p53 bằng cách bám vào p53, kích thích phân giải p53 nhờ enzym ubiquitin ligase [57]. Hậu quả, tế bào vẫn tiếp tục phân chia, không có sự kiếm soát và phát trien thành khối u.
EBV là loại virus nhiễm phổ biến trong cộng đồng còn gọi là Herpes virus type 4, thuộc họ Herpesviridae [26]. EBV gây bệnh trên người và lây truyền qua đường tiêu hoá, có đặc tính thích ứng tế bào Lympho B và là nguyên nhân gây bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn (IM), liên quan đến cơ chế tiến triến của một số loại ung thư như: tăng sinh lympho B, ung thư biếu mô như ung thư VMH và ung thư dạ dày… Tuy nhiên, EBV có khả năng gây sơ nhiễm và tồn tại lâu dài trong cơ thế mà không gây bệnh. Cấu trúc hệ gen của EBV là DNA sợi đôi xoắn kép, mạch hở, kích thước khoảng 172 kb, nếu tính cả phần cấu trúc lặp ở hai đầu là 184 kb, mã hoá cho 9 protein virus. Trong đó, gen EBNA-1 là một đoạn DNA nằm trong tổ hợp gen EBNA protein kháng nguyên, có vai trò thiết yếu trong quá trình xâm nhập và nhân lên cũng như duy trì sự tái tạo hệ gen của virus, bên cạnh đó protein EBNA-1 còn ngăn cản quá trình phân giải và trình diện kháng nguyên của virus ở tế bào nhiễm. Gen EBNA-1 và sản phẩm protein EBNA-1 có mặt trong tất cả các khối u có liên quan đến EBV. Như vậy, với sự hiếu biết về các đặc tính sinh học phân tử của HPV và EBV, cùng với sự phát triến của các kĩ thuật ứng dụng sinh học phân tử, hoàn toàn có thế giúp cho việc phát hiện sớm và chính xác HPV và EBV trên bệnh nhân, phục vụ chẩn đoán và áp dụng các biện pháp điều trị sớm nhằm ngăn chặn sự tiến triến của bệnh, giảm tỷ lệ tử vong do các ung thư mà chúng gây ra. Hiện nay, ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu tìm hiếu đặc tính, định loại và xác định týp một cách chính xác, có hệ thống về HPV và EBV. Việc nghiên cứu ứng dụng PCR trong chẩn đoán phát hiện HPV và EBV cũng đã được thực hiện gần đây, nhưng còn nhiều hạn chế như: quy trình thực hiện phức tạp, thời gian trả lời kết quả kéo dài và giá thành xét nghiệm.
Xuất phát trên cơ sở phân tích những công trình nghiên cứu có liên quan, những kết quả mới nhất trong lĩnh vực nghiên cứu về Human papilloma virus (HPV) và Epstein-Barr Virus (EBV), chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Xác định trình tự gen E6 và L1 của HPV và gen EBNA-1 của EBV để ứng dụng trong chuẩn đoán ung thư cổ tử cung và vòm mũi họng” với mục tiêu nghiên cứu:
1. Thu nhận chuỗi gen E6 của HPV-16 và chuỗi gen L1 của HPV-18, ở một số chủng Human papilloma virus (HPV) bằng cặp mồi thử nghiệm đế nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử và so sánh với các chủng của Việt Nam và thế giới.
2. Thu nhận chuỗi gen EBNA-1 của một số chủng Epstein-Barr Virus (EBV) bằng cặp mồi thử nghiệm đế nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử và so sánh với các chủng của Việt Nam và thế giới.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Phạm Thị Hoàng Anh, Nguyễn Mạnh Quốc, Nguyễn Bá Đức, Nguyễn Chấn Hùng (2001), “Tình hình bệnh ung thư ở Việt Nam năm 2000”, Tạp chí thông tin Y dược 2/2001, Bộ Y tế – Viện thông tin Yhọc Trung ương, tr. 3- 11.
2. Bộ môn Vi Sinh (2001), Vi Sinh Y học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 386.
3. Trịnh Quang Diện (1995), Phát hiện các dị sản, loạn sản và ung thư cổ tử cung bằng phương phát tế bào học, Luận án Tiến sỹ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội.
4. Trịnh Quang Diện (2002), Theo dõi bằng tế bào học và mô bệnh học các tế bào bào vẩy không điển hình ý nghĩa chưa xác định (ASCUS) gặp trong phát hiện tế học các tổn thương nội biểu mô và ung thư cổ tử cung, Chuyên đề ung thư học, Y học thực hành, Nhà xuất bản Y học, số 431, tr. 266- 269.
5. Đào Trung Dũng (2003), Chẩn đoán tế bào học ASCUS trong phát hiện sớm ung thư cổ tử cung, Luận văn Bác sỹ Y khoa, Trường Đại học Y Hà Nội.
6. Phan Trường Duyệt, Đinh Thế Mỹ (2003), Lâm sàng sản phụ khoa, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 444- 448.
7. Nguyễn Văn Đô, Phan Thị Phi Phi (2003), Xác định đột biến mất đoạn 30bp và đột biến điểm của gen EBV-LMP ở bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Việt Nam, Hội nghị sinh học phân tử và hoá sinh toàn quốc, tr. 129-134.
8. Phạm Thị Hồng Hà (2000), Giá trị của phiến đồ âm đạo – cổ tử cung, soi cổ tử cung và mô bệnh học trong việc phát hiện sớm ung thư cổ tử cung, Luận văn Thạc sỹ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội.
9. Lê Thanh Hoà (2006), Y – Sinh học phân tử, Quyển I, Nhà xuất bản y học, Hà Nội, tr. 64- 85.
10. Lê Thanh Hòa, Vũ Thị Tiến, Hoàng Thị Minh Châu, Lê Thanh Hà, Nguyễn Đình Phúc (2010), Xác định 3 phân typP-ala, P-thr và V-val của EBNA-1 ở EBV phân lập tại Việt Nam, Tạp chí Nghiên cứu Y học 70(5), tr. 8-12.
11. Vương Tiến Hoà (2004), Một số vấn đề bệnh lý cổ tử cung, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
12. Trần Phương Mai (1999), Nhận xét 89 trường hợp ung thư cổ tử cung tại Viện BVBM TSS trong 6 năm (1992- 1997), Tạp chí Y học thực hành số 1/1999, tr. 37- 39.
13. Phan Thị Phi Phi (2005), Báo cáo tổng quan các đặc điểm sinh học chủ yếu gặp ở bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Việt Nam và một số ứng dụng lâm sàng. Hội thảo chuyên đề ung thư vòm mũi họng, Hà Nội (07-09.11.2005).
14. Nguyễn Đình Phúc (2006), “Nghiên cứu chẩn đoán lâm sàng và gen virus Epstein – Barr trong ung thư vòm mũi họng’’, Luận án TS khoa học Y học – ĐHYHN.
15. Nguyễn Quốc Trực, Lê Văn Xuân (2000), Chẩn đoán và điều trị các thương tổn tiền ung thư cổ tử cung, Tạp chí thông tin Y – Dược 8/2000, Viện thông tin Y học Trung ương, tr. 220- 224.
Tiếng Anh
16. Apt D, Watts RM, Suske G, U Bernard U (1996), “High Sp1/Sp3 ratios in epithelial cells during epithelial differentiation and cellular transcription correlate with the activation of the HPV-16 promoter”, Virology, 224, pp. 281- 291.
17. Bosch F, Manos MM, Munoz N, Sherman M, Jansen AM, Peto J, Schiffman M H, Moreno V, Kurman R, Shah KV, International Biological Study on Cervical Cancer (IBSCC) Study Group (1995), “Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective”,/. Natl. Cancer Inst, 87, pp. 796-802.
18. Bosch FX, Munoz N (2002), “The viral etiology of cervical cancer”, Virus Res. 89, pp. 183-190.
19. Bosch FX, Lorincz A, Munoz N, Meijer CJ, Shah KV (2002), “The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer”, J. Clin. Pathol. 55, pp. 244-265.
Trang phụ bìa Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. UNG THƯ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV)…. 4 1.1.1 Dịch tễ học ung thư cổ tử cung 4
1.1. LL Trên thế giới 4
1.1.1.2. Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam 6
1.1.1.3. Các yếu tố có nguy cơ đối với ung thư CTC 6
1.1.1.4. Human papilloma virus và bệnh ung thư cổ tử cung 6
1.1.2. Phân loại và đặc tính sinh học của Papilloma virus 9
1.1.2.1. Phân loại Papilloma virus 9
1.1.2.2. Đặc tính sinh học của Human Papillomavirus 12
1.1.2.3. Quá trình nhân lên của HPV 14
1.1.2.4. Cơ chế gây ung thư cổ tử cung của HPV 16
1.1.3. Chẩn đoán ung thư CTC 17
1.1.3.1. Chẩn đoán tế bào học 17
1.1.3.2. Chẩn đoán dựa trên phân tích mRNA 19
1.1.3.3. Định týp HPV bằng sinh học phân tử 19
1.1.4. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng phương pháp PCR chẩn đoán nhanh HPV gây ung thư cổ tử cung ở Việt Nam… 21
1.2. UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG VÀ EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV) 22
1.2.1. Dịch tễ học ung thư vòm mũi họng 22
1.2.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 22
1.2.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 23
1.2.2. Đặc tính sinh học của Epstein-Bar virus (EBV) 24
1.2.2.1. Phát hiện virus Epstein – Barr và ung thư VMH 24
1.2.2.2. Đặc điểm phân loại và cấu trúc EBV 25
1.2.2.3. Sự nhân lên, tàng nhiễm và khả năng gây ung thư của
EBV 26
1.2.2.4. Sinh học phân tử và sắp xếp hệ gene của EBV 28
1.2.2.5. Gene và sản phẩm của gene EBNA-1 29
1.2.3. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng
phương pháp PCR chẩn đoán sớm EBV ung thư vòm mũi họng ở Việt Nam 30
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
2.1. Đối tượng nghiên cứu 33
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu và hoá chất nghiên cứu 33
2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị 33
2.2.2. Hoá chất 3 3
2.3. Phương pháp nghiên cứu 34
2.4. Quy trình nghiên cứu 35
2.4.1. Lấy mẫu và bảo quản 35
2.4.2. Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số 35
2.4.3. Quy trình phản ứng PCR và kiểm tra sản phẩm PCR 37
2.4.3.1. Thiết kế mồi 37
2.4.3.2. Quy trình phản ứng PCR 38
2.4.3.3. Kỹ thuật phát hiện sản phẩm PCR 40
2.4.3.4. Tinh sạch sản phẩm PCR 41
2.4.4. Phương pháp tạo dòng sản phẩm PCR 42
2.4.4.1. Tạo vectơ tái tổ hợp 42
2.4.4.2. Chuyển nạp 43
2.4.4.3. Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp 44
2.4.4.4. Tách DNA plasmid tái tổ hợp 45
2.4.4.5. Kiểm tra DNA tái tổ hợp 47
2.4.5. Giải trình trình tự và xử lý số liệu 48
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51
3.1. Kết quả thu nhận, giải trình trình tự và xác định gen E6 của HPV-16 và L1 của HPV-18 51
3.1.1. Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm 51
3.1.2. Kết quả thực hiện phản ứng Multiplex-PCR phát hiện HPV-16 và
HPV-18 52
3.1.3. Kết quả tách dòng và giải trình tự các sản phẩm HPV-16 và
HPV-18 từ các mẫu kiểm tra 53
3.1.4. Kết quả giải trình tự và thu nhận chuỗi gen E6 của HPV-16 và
chuỗi gen L1 của HPV-18 54
3.1.5. Kết quả truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen E6 của
HPV16 và L1 của HPV18 5 6
3.1.6. Kết quả bước đầu phát hiện HPV-16 và HPV-18 bằng phương
pháp đa mồi multiplex-PCR 59
3.2. Kết quả thu nhận, giải trình trình tự và xác định gen EBNA – 1 của
EBV 60
3.2.1. Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm 60
3.2.2. Kết quả thực hiện phản ứng PCR 61
3.2.3. Kết quả giải trình tự và thu nhận chuỗi gen EBNA-1 của EBV 62
3.2.4. Kết quả truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen EBNA-1
của EBV 63
3.2.5. Kết quả xác định phân týp EBV qua phân tích vị trí acid amin số 487 của EBNA-1 thu nhận với chuỗi gen tương ứng của các chủng Việt
Nam và thế giới 64
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69
4.1. KẾT LUẬN 69
4.2. KIẾN NGHỊ 70
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC