Nghiên cứu chế tạo bộ  xét nghiệm ELISA phát hiện nọc rắn độc và ứng dụng lâm sàng chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam

Luận án Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm ELISA phát hiện nọc rắn độc và ứng dụng lâm sàngchẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam. Rắn độc cắn là một trong những tai nạn nguy hiểm thường gặp ở cácnước  nhiệt đới,  với  trên  2,5  triệu  người  bị  rắn độc cắn  và  khoảng  125.000người tử vong do rắn độc cắn mỗi năm [39], [40], [66], [68], [121]. Ở nước ta,các chuyên gia ước tính mỗi năm có khoảng 30.000 người bị rắn cắn nhưngphần lớn không được báo cáo ghi nhận đầy đủ do nạn nhân tử vong trước khikịp đến cơ sở y tế hoặc được cấp cứu và điều trị theo các biện pháp dân gian[wilken].  Thống  kê  số  liệu  của  gần  hai  nghìn  bệnh  nhân  rắn độc  cắn  nhậpviện, các chuyên gia của Bệnh viện Chợ Rẫy nhận định một số loài rắn độcthường gây tai nạn rắn cắn nhất ở khu vực Miền Nam nước ta là rắn lục xanh(43,3%),  hổ đất  (23,8%),  chàm  quạp  (19,4%),  hổ  mèo  (10%) và  hổ  chúa(1,2%) [77].

Nhiễm độc nọc rắn nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn đến tửvong hoặc để lại di chứng nặng nề, ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sốngcủa nạn nhân sau khi sống sót [39]. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, phương phápđiều  trị  hiệu  quả  nhất cho  bệnh  nhân  bị  nhiễm độc nọc  rắn  là huyết  thanhkháng nọc  rắn  (HTKNR) [114]. Ở  Việt Nam, đã  có 2 loại HTKNR  thươngphẩm được sử dụng trên lâm sàng đó là huyết thanh kháng nọc rắn lục xanhvà hổ đất do Viện vắc xin và Sinh phẩm y tế (IVAC) ở Nha Trang sản xuất.

Tuy nhiên, việc sử dụng 2 loại huyết thanh kháng nọc rắn đơn đặc hiệu nàychỉ thực sự hiệu quả khi xác định sớm và chính xác loài rắn độc đã gây ra tainạn rắn cắn [2]. Cho đến nay, ở nước ta việc chẩn đoán loài rắn độc đã gây ratai nạn rắn cắn để sử dụng HTKNR chủ yếu dựa vào kinh nghiệm lâm sàng,do đó thường bị hạn chế và chỉ được thực hiện ở các bệnh viện tuyến cuối nơicó các chuyên gia nhiều kinh nghiệm.

Hiện nay trên thế giới đã có một số loại xét nghiệm được dùng để pháthiện nọc rắn độc của Úc, Ấn Độ và Đài Loan ngay trên thực địa và lâm sàng2tại các nước này. Tuy nhiên, do đặc điểm địa lý khác nhau nên có sự phân bốcác loài rắn khác nhau giữa các vùng địa lý. Từ đó, xét nghiệm phát hiện nọccủa loài rắn độc có ở khu vực này không sử dụng được để phát hiện nọc củaloài  rắn  có  ở  khu  vực  khác [15],  [56]. Do  vậy, cần  phải  phát  triển  các  xétnghiệm phát hiện riêng nọc rắn của các loài rắn độc sinh sống ở Việt Nam màcho tới nay nước ta vẫn chưa có [5].

Bộ xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc là bộ xét nghiệm cấp cứu; Ngoài khả năng phát hiện nhanh và chính xác nọc độc, bộ xét nghiệm này còn đòihỏi phải đơn giản, dễ sử dụng, bền vững trong các điều kiện bảo quản và sửdụng ở thực địa, nơi có trang thiết bị tối thiểu. Với các lý do trên, kỹ thuật hấpphụ  miễn  dịch  gắn  enzym (enzyme-linked  immunosorbent  assay: ELISA)thường được áp dụng cho mục đích này. Trong các dạng xét nghiệm ELISA,thì ELISA  sandwich  sử  dụng  hệ  khuếch đại  avidin-biotin  (AB-ELISA) vàELISA sandwich sử dụng kháng thể thứ ba gắn enzym (AbE-ELISA) là haidạng thiết kế được ứng dụng nhiều nhất trong phát triển bộ xét nghiệm pháthiện nọc rắn độc.

Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên, đề tài: “Nghiên cứu chế tạo  bộ  xét  nghiệm  ELISA  phát  hiện  nọc  rắn độc  và  ứng  dụng  lâm  sàng chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam” được tiến hành nhằm:

1. Chế  tạo  bộ  xét  nghiệm AB-ELISA phát  hiện  nọc độc của 4 loài  rắn lục xanh, hổ đất, chàm  quạp, hổ chúa và phát triển bộ xét nghiệm AbE-ELISAphát hiện nọc độc của 2 loài rắn lục xanh và hổ đất ở Việt Nam.
2. Đánh giá hiệu quả phát hiện nọc và định loài rắn độc của bộ xét nghiệm ELISA trong các bệnh phẩm lâm sàn

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các biểu đồ

Danh mục các sơ đồ

Danh mục các hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1. Tai nạn rắn cắn và chẩn đoán rắn độc cắn 3

1.1.1. Một số loài rắn độc thường gặp gây ra tai nạn rắn cắn ở

Việt Nam

3

1.1.2. Một số đặc điểm lâm sàng rắn độc cắn 8

1.1.3. Chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam 11

1.2. Kháng thể kháng nọc rắn và một số kỹ thuật miễn dịch phát

hiện nọc rắn độc

13

1.2.1. Kháng thể kháng nọc rắn 13

1.2.2. Một số kỹ thuật miễn dịch phát hiện nọc rắn độc 19

1.3. Xét nghiệm ELISA 25

1.3.1. Lựa chọn xét nghiệm ELISA trong chế tạo bộ xét

nghiệm phát hiện nọc rắn độc

25

1.3.2. Một số thiết kế xét nghiệm ELISA được ứng dụng trong

chế tạo bộ xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc

26

1.3.3. Một số chỉ tiêu đánh giá xét nghiệm ELISA 32

1.3.4. Bộ xét nghiệm ELISA thương phẩm phát hiện nọc rắn

độc

33

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 36

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 36

2.1.2. Vật liệu nghiên cứu 36

2.2. Phương pháp nghiên cứu 38

2.2.1. Chế tạo kháng nguyên và gây miễn dịch tạo huyết thanh

thỏ kháng nọc rắn

39

2.2.2. Xét nghiệm ELISA gián tiếp (indirect ELISA) 41

2.2.3. Tinh chế kháng thể 43

2.2.4. Gắn Biotin vào kháng thể 44

2.2.5. Chuẩn bị huyết thanh ngựa đặc hiệu nọc rắn lục xanh và

hổ đất do IVAC cung cấp

45

2.2.6. Bộ xét nghiệm AB-ELISA phát hiện nọc rắn độc 45

2.2.7. Bộ xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc rắn độc 49

2.2.8. Đánh  giá  hiệu  quả  phát  hiện  nọc  rắn độc  của  bộ  xét

nghiệm AbE-ELISA trong các bệnh phẩm lâm sàng

55

2.3. Xử lý số liệu 56

2.4. Đạo đức nghiên cứu 56

CHƯƠNG 3: KẾT QỦA NGHIÊN CỨU 58

3.1. Bộ xét nghiệm AB-ELISA phát hiện nọc độc của 4 loài rắn lục

xanh, hổ đất, chàm quạp và hổ chúa

58

3.1.1. Bốn loại kháng thể thỏ đặc hiệu loài rắn dùng trong bộ

xét nghiệm AB-ELISA

58

3.1.2. Bộ xét nghiệm AB-ELISA phát hiện nọc của 4 loài rắn:

lục xanh, hổ đất, chàm quạp và hổ chúa

64

3.1.3. Độ nhạy và khả năng phát hiện nọc rắn độc của bộ xét

nghiệm AB-ELISA trong phòng thí nghiệm

66

3.1.4. Độ ổn định của xét nghiệm AB-ELISA 67

3.2. Bộ xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc độc của 2 loài rắn

lục xanh và hổ đất

68

3.2.1. Bộ xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc rắn lục xanh

và hổ đất

68

3.2.2. Điều kiện tối ưu của phản ứng AbE-ELISA 69

3.2.3. Độ nhạy và khả năng phát hiện nọc rắn độc của bộ xét

nghiệm AbE-ELISA trong phòng thí nghiệm

71

3.2.4. Phản ứng chéo của xét nghiệm AbE-ELISA với nọc của

một số loài rắn độc khác ở Việt Nam

73

3.2.5. Độ ổn định của bộ xét nghiệm AbE-ELISA 74

3.3. Hiệu quả phát hiện nọc và định loài rắn độc của bộ xét nghiệm

ELISA trong các bệnh phẩm lâm sàng

75

3.3.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 75

3.3.2. Kết quả xét nghiệm  phát hiện nọc và định loài rắn độc

của  xét  nghiệm  AbE-ELISA  trong các bệnh  phẩm  lâm

sàng

78

3.3.3. Hình ảnh minh họa sự phù hợp giữa kết quả xét nghiệm

ELISA  phát  hiện  nọc  rắn độc với điều  trị  HTKNR đặc

hiệu trên lâm sàng

83

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 85

4.1. Bộ xét nghiệm AB-ELISA phát hiện nọc độc của 4 loài rắn lục

xanh, hổ đất, chàm quạp và hổ chúa

85

4.1.1. Bốn loại kháng thể thỏ đặc hiệu loài rắn dùng trong bộ

xét nghiệm AB-ELISA

85

4.1.2. Bộ xét nghiệm AB-ELISA phát hiện nọc độc của 4 loài

rắn lục xanh, hổ đất, chàm quạp và hổ chúa

89

4.1.3. Độ nhạy của xét nghiệm AB-ELISA 91

4.1.4. Độ ổn định của bộ xét nghiệm AB-ELISA 92

4.2. Bộ xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc độc của 2 loài rắn

lục xanh và hổ đất

93

4.2.1. Bộ xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc độc của 2 loài

rắn lục xanh và hổ đất

93

4.2.2. Điều kiện tối ưu của phản ứng AbE-ELISA 94

4.2.3. Độ nhạy của xét nghiệm AbE-ELISA 96

4.2.4. Phản ứng chéo của xét nghiệm AbE-ELISA với nọc của

một số loài rắn độc khác ở Việt Nam

97

4.2.5. Độ ổn định của bộ xét nghiệm AbE-ELISA 98

4.3. Hiệu quả phát hiện nọc và định loài rắn độc của bộ xét nghiệm

ELISA trong các bệnh phẩm lâm sàng

98

4.3.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 98

4.3.2. Kết quả xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc và định

loài rắn độc trong các bệnh phẩm lâm sàng

100

4.3.3. Sự  phù  hợp  giữa kết  quả  xét  nghiệm  ELISA  phát  hiện

nọc rắn độc với điều trị HTKNR đặc hiệu trên lâm sàng

108

KẾT LUẬN 110

KIẾN NGHỊ 112

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC