Nghiên cưu đặc điểm thực vật, thanh phần hóa học và tác dụng kháng viêm của một số loài thuộc chi Balanophora

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cưu đặc điểm thực vật, thanh phần hóa học và tác dụng kháng viêm của một số loài thuộc chi Balanophora J.R.&G. Forst. ơ Việt Nam.Họ Dó đất (Balanophoraceae Rich.) là một họ thực vật bậc cao với 16 chi, khoảng hơn 40 loài cây thảo, sống ký sinh [132]. Ở Việt Nam có 2 chi bao gồm chi Sơn dương (Rhopalocnemis Jungh.) với duy nhất một loài (R. phalloides Jungh.) và chi Dó đất (Balanophora J.R. & G. Forst.) với 7 loài, 1 phân loài và 1 thứ [4], [12]. Ở Trung Quốc, các loài trong chi Balanophora đa được sử dụng làm dược liệu từ hàng ngàn năm nay với các tác dụng chủ yếu như bổ thận, cầm máu, điều trị viêm gan [137]. Ở Việt Nam, các loài thuộc chi Balanophora thường được gọi với tên Dó đất, Nấm ngọc cẩu, hay Tỏa dương và cũng được sử dụng với mục đích khác nhau [6].
Trong ba loài được ghi nhận sử dụng làm thuốc ở Việt Nam, Dó đất hoa thưa (Balanophora laxiflora Hemsl.) là loài được tập trung nghiên cứu nhiều cả về thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học, trong đó đáng chú ý là tác dụng kháng viêm [1] được đánh giá trên các mô hình in vitro và in vivo. Phân đoạn ethyl acetat và cao toàn phần loài B. laxiflora thể hiện tác dụng kháng viêm in vivo trên các mô hình gây phù chân chuột và mô hình tạo u hạt ở cả 2 mức liều 150 mg/kg và 300 mg/kg. Một số hợp chất phân lập từ loài này cũng thể hiện tác dụng kháng viêm in vitro đáng chú ý. Bên cạnh đó, loài B. laxiflora cũng thể hiện tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase và hạ acid uric [2],[9]. Như đa biết, nồng độ acid uric trong máu tăng cao thời gian dài có thể dẫn tới tình trạng kết tinh và lắng đọng tinh thể urat tại khớp và gây ra bệnh gút cấp với triệu chứng điển hình là viêm, sưng, nóng, đỏ, đau. Ngoài ra, theo các nghiên cứu trên thế giới, một số loài cũng thể hiện tác dụng kháng viêm khá tốt như: B. spicata [32], B. polyandra [52]. Như vậy, có thể thấy các loài thuộc chi Balanophora có tiềm năng kháng viêm đáng chú ý, trong đó có cả khả năng ngăn chặn nguy cơ xảy ra viêm do bệnh gút.2

Kết hợp khảo sát ban đầu và tham khảo tài liệu cho thấy chi Balanophora ở Việt Nam khá đa dạng về loài, dưới loài; có những loài chưa được ghi nhận ở Việt lẫn khi thu hái hoặc sử dụng trộn lẫn các loài thuộc chi Balanophora, bao gồm cả các loài đa được ghi nhận dùng làm thuốc và các loài cùng chi khác. Do đó, cần một nghiên cứu tương đối có tính hệ thống về đặc điểm thực vật, thành phần hoá học cũng như một số tác dụng sinh học của các loài này để làm rõ hơn sự đa dạng về loài, tiềm năng phát triển và sử dụng hợp lý. Đề tài: “Nghiên cưu đặc điểm thực vật, thanh phần hóa học và tác dụng kháng viêm của một số loài thuộc chi Balanophora J.R.&G. Forst. ơ Việt Nam” là cần thiết.
Đề tài được tiến hành với các mục tiêu như sau:
1. Xác định chính xác tên khoa học, mô tả đặc điểm thực vật một số loài thuộc chi Balanophora ở Việt Nam.
2. Nghiên cứu thành phần hóa học các loài thu được.
3. Đánh giá một số hoạt tính in vitro của cắn chiết các loài nghiên cứu và lựa chọn một loài có hoạt tính tốt để đánh giá tác dụng kháng viêm, hạ acid uric.
Để thực hiện mục tiêu trên, đề tài được tiến hành với các nội dung:
– Nghiên cứu đặc điểm hình thái một số loài thuộc chi Dó đất ở Việt Nam, giám định tên khoa học các mẫu nghiên cứu. Nghiên cứu đặc điểm hiển vi bao gồm vi phẫu củ, vi phẫu lá và đặc điểm bột, hình thái hạt phấn.
– Nghiên cứu thành phần hóa học các loài thu được: chiết xuất cao chiết tổng, phân đoạn với các dung môi n-hexan và ethyl acetat. Nghiên cứu thành phần hóa học của cao chiết tổng và các phân đoạn sử dụng các phương pháp: phân lập và xác định cấu trúc, sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao, sắc ký lỏng ghép nối khối phổ, sắc ký khí kết nối khối phổ.
– Đánh giá tác dụng ức chế sản sinh nitric oxid trên tế bào RAW264.7 và tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của cao chiết tổng. Trên cơ sở đó, lựa chọn một loài có hoạt tính tốt để nghiên cứu trên các mô hình in vivo và độc tính cấp

Mục lục
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………………………………….1
Chương 1. TỔNG QUAN …………………………………………………………………………….3
1.1. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Balanophora
J.R.&G.Forst………………………………………………………………………………………….3
1.1.1. Vị trí phân loại chi Balanophora J.R.&G.Forst……………………………….3
1.1.2. Đặc điểm thực vật chi Balanophora J.R.&G.Forst…………………………..4
1.1.3. Các loài thuộc chi Balanophora J.R.&G. Forst. và phân bố……………..5
1.1.4. Một số khóa phân loại chi Balanophora J.R.&G.Forst. ………………….11
1.2. Tổng quan các nghiên cứu về thành phần hóa học chi Balanophora
J.R.&G.Forst………………………………………………………………………………………..15
1.2.1. Các tanin thủy phân được……………………………………………………………15
1.2.2. Các acid hydroxybenzoic và dẫn chất…………………………………………..19
1.2.3. Các Phenylpropanoid đơn giản……………………………………………………20
1.2.4. Các hợp chất lignan……………………………………………………………………24
1.2.5. Các coumarin…………………………………………………………………………….27
1.2.6. Các flavonoid…………………………………………………………………………….28
1.2.7. Các terpenoid…………………………………………………………………………….30
1.2.8. Các steroid………………………………………………………………………………..32
1.2.9. Các nhóm hợp chất khác …………………………………………………………….33
1.3. Tổng quan về công dụng, tác dụng sinh học chi Balanophora J.R.&G.Forst.
……………………………………………………………………………………………………………33
1.3.1. Công dụng của các loài thuộc chi Balanophora…………………………….33
1.3.2. Nghiên cứu trên thế giới về tác dụng sinh học chi Balanophora………34
1.3.3. Nghiên cứu tại Việt Nam về tác dụng sinh học chi Balanophora ……..40
1.4. Tổng quan về một số mô hình nghiên cứu tác dụng kháng viêm thường dùng
và một số mô hình liên quan …………………………………………………………………..421.4.1. Một số mô hình nghiên cứu tác dụng kháng viêm in vitro ……………….42
1.4.2. Một số mô hình nghiên cứu tác dụng kháng viêm in vivo ………………..43
1.4.2.1. Các mô hình gây viêm cấp và bán cấp……………………………………….44
1.4.2.2. Một số mô hình gây viêm mạn tính…………………………………………….45
1.4.3. Một số mô hình nghiên cứu tác dụng hạ acid uric và ức chế xanthin
oxidase ……………………………………………………………………………………………….46
1.4.3.1. Một số mô hình in vitro…………………………………………………………….47
1.4.3.2. Một số mô hình in vivo …………………………………………………………….47
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU………………………………………………………………………………………….48
2.1. Nguyên vật liệu ……………………………………………………………………………..48
2.1.1. Mẫu nghiên cứu …………………………………………………………………………48
2.1.1.1. Nguyên liệu cho nội dung nghiên cứu về hóa học………………………..48
2.1.1.2. Nguyên liệu cho nội dung nghiên cứu về tác dụng sinh học và độc
tính …………………………………………………………………………………………………….49
2.1.2. Hóa chất, dung môi…………………………………………………………………….50
2.1.3. Động vật thí nghiệm …………………………………………………………………..51
2.2. Thiết bị nghiên cứu ………………………………………………………………………..51
2.3. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………………………..53
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu thực vật………………………………………………..53
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học……………………………….54
2.3.2.1. Định tính các nhóm chất trong các loài nghiên cứu …………………….54
2.3.2.2. Phân lập hợp chất từ các loài nghiên cứu…………………………………..54
2.3.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất được phân lập ……………..55
2.3.2.4. Triển khai sắc ký lớp mỏng một số loài nghiên cứu……………………..55
2.3.2.5. Phân tích thành phần hóa học sử dụng sắc ký lỏng kết nối khối
phổ……………………………………………………………………………………………………..562.3.2.6. Phân tích thành phần triterpenoid trong phân đoạn n-hexan của các
loài nghiên cứu sử dụng sắc ký khí kết nối khối phổ …………………………………56
2.3.2.7. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol toàn phần …………….56
2.3.3. Phương pháp đánh giá một số tác dụng in vitro …………………………….58
2.3.3.1. Phương pháp đánh giá tác dụng kháng viêm thông qua ức chế sản
sinh NO ………………………………………………………………………………………………59
2.3.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym xanthin oxidase in
vitro ……………………………………………………………………………………………………60
2.3.4. Phương pháp đánh giá tác dụng sinh học in vivo …………………………..61
2.3.4.1. Đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh trên mô hinh gây tăng
cấp acid uric băng kali oxonat ………………………………………………………………61
2.3.4.2. Đánh giá tác dụng kháng viêm cấp trên mô hình gây phù băng
carrageenan ………………………………………………………………………………………..63
2.3.4.3. Phương pháp đánh giá tác dụng kháng viêm trên mô hình gây viêm
màng hoạt dịch khớp gối băng tinh thể natri urat…………………………………….65
2.3.4.4. Đánh giá độc tính cấp ……………………………………………………………..67
2.4. Xử lý số liệu ………………………………………………………………………………….68
2.5. Địa điểm thực hiện…………………………………………………………………………69
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU …………………………………………………………70
3.1. Kết quả nghiên cứu về thực vật ……………………………………………………….70
3.1.1. Kết quả nghiên cứu về hình thái thực vật và xác định tên khoa học các
mẫu nghiên cứu……………………………………………………………………………………70
3.1.1.1. Đặc điểm hinh thái và xác định tên khoa học mẫu BFI ………………..70
3.1.1.2. Đặc điểm hinh thái và xác định tên khoa học mẫu BFG……………….72
3.1.1.3. Đặc điểm hinh thái và xác định tên khoa học mẫu BS………………….74
3.1.1.4. Đặc điểm hinh thái và xác định tên khoa học mẫu BT………………….76
3.1.2. Kết quả nghiên cứu về hình thái hạt phấn các loài nghiên cứu………..78
3.2. Kết quả nghiên cứu về hóa học………………………………………………………..853.2.1. Định tính các nhóm chất……………………………………………………………..85
3.2.2. Kết quả phân lập các hợp chất từ một số loài nghiên cứu……………….87
3.2.2.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất từ Dó đất (Balanophora
fungosa subsp. indica) ………………………………………………………………………….87
3.2.2.2. Kết quả chiết xuất và phân lập các hợp chất từ Dó đất sần
(Balanophora fungosa var. globosa)………………………………………………………93
3.2.2.3. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất từ loài Balanophora
tobiracola……………………………………………………………………………………………87
3.2.2.4. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất từ loài Balanophora
subcupularis………………………………………………………………………………………103
3.2.3. Kết quả phân tích sử dụng sắc ký lỏng kết nối khối phổ………………..105
3.2.5. Kết quả phân tích sử dụng sắc ký khí ghép nối khối phổ ……………….121
3.3. Kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học………………………………………..125
3.3.1. Kết quả sàng lọc một số tác dụng in vitro của cắn methanol các loài
nghiên cứu…………………………………………………………………………………………125
3.3.1.1. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxid của cắn
methanol các loài nghiên cứu………………………………………………………………125
3.3.1.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của cắn
methanol các loài nghiên cứu………………………………………………………………127
3.3.2. Kết quả đánh giá một số tác dụng trên in vivo cao chiết Dó đất…….129
3.3.2.1. Tác dụng hạ acid uric huyết thanh…………………………………………..129
3.3.2.2. Tác dụng kháng viêm trên mô hình gây phù chân chuột băng
carrageenan ………………………………………………………………………………………130
3.3.2.3. Tác dụng kháng viêm trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp
gối băng tinh thể natri urat………………………………………………………………….131
3.3.3. Kết quả đánh giá độc tính cấp cao chiết Dó đất…………………………..132
3.3.3.1. Thử nghiệm thăm dò ………………………………………………………………132
3.3.3.2. Thử nghiệm chính thức …………………………………………………………..133Chương 4. BÀN LUẬN ……………………………………………………………………………135
4.1. Về kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật………………………………………..135
4.1.1. Đặc điểm hinh thái và xác định tên khoa học ………………………………135
4.1.2. Đặc điểm hiển vi ………………………………………………………………………138
4.2. Về kết quả nghiên cứu thành phần hóa học……………………………………..139
4.2.1. Kết quả định tính sơ bộ……………………………………………………………..139
4.2.2. Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất ………………………………..139
4.2.3. Sử dụng các phương pháp sắc ký trong nghiên cứu………………………140
4.2.3.1. Sắc ký lớp mỏng…………………………………………………………………….141
4.2.3.2. Sắc ký khí ……………………………………………………………………………..142
4.2.3.3. Sắc ký lỏng kết nối khối phổ ……………………………………………………145
4.3. Về kết quả đánh giá tác dụng sinh học và độc tính cấp …………………….147
4.3.1. Về tác dụng sinh học của cao chiết dược liệu ………………………………147
4.3.2. Về độc tính cấp ………………………………………………………………………..148
4.3.3. Về tác dụng sinh học của một số hợp chất được xác định trong các loài
nghiên cứu…………………………………………………………………………………………148
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………………………………15