Nghiên cứu phân lập, bảo quản, hoạt hóa và đánh giá hiệu quả điều trị của tế bào gốc mô mỡ tự thân đối với bệnh nhân thoái hoá khớp gối

Luận án Nghiên cứu phân lập, bảo quản, hoạt hóa và đánh giá hiệu quả điều trị của tế bào gốc mô mỡ tự thân đối với bệnh nhân thoái hoá khớp gối.Thoái hóa khớp là một bệnh hay gặp trong các bệnh về xương khớp và được xem là nguyên nhân hàng đầu gây đau đớn và tàn phế ở người lớn tuổi tại Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới. Năm 2010, ở Mỹ có trên 27 triệu người mắc bệnh thoái hóa khớp trong khi ở Anh là trên 8 triệu người [52]. Bệnh lý này có đặc điểm là tăng dần tình trạng thoái hóa của sụn khớp và phần xương dưới sụn. Trong các khớp của cơ thể, khớp gối là vị trí thoái hóa thường gặp nhất [24]. Tình trạng đau đớn và mất chức năng liên quan tới thoái hóa khớp gối ảnh hưởng xấu tới chất lượng cuộc sống, hạn chế khả năng lao động và những hoạt động sinh hoạt thường ngày của bệnh nhân.

Trái ngược với sự tiến triển tăng dần của bệnh lý thoái hóa khớp gối, cho đến nay vẫn còn rất ít biện pháp điều trị hữu hiệu có tác dụng ngăn chặn căn bệnh này. Phần lớn các biện pháp như dùng thuốc giảm đau, chống viêm và bổ xung dịch khớp chỉ có tác dụng điều trị triệu trứng cho người bệnh mà không giải quyết được quá trình tiến triển của bệnh thoái hóa khớp. Can thiệp ngoại khoa như nội soi cắt bỏ gai mâm chày, phục hồi các dây chằng, cấy sụn, thay khớp… có thể đưa tới các biến chứng sau phẫu thuật như tắc mạch, nhiễm khuẩn hay xa hơn là lỏng khớp. Chính vì vậy việc nghiên cứu tìm ra một phương pháp mới, thực sự tác động tới quá trình phục hồi sụn là một việc làm cấp thiết nhằm đem lại kết quả cao trong điều trị bệnh.

Những nghiên cứu gần đây đã cho thấy công nghệ tạo các mô với việc sử dụng tế bào gốc phôi hoặc tế bào gốc trưởng thành có tiềm năng điều trị to lớn, đặc biệt các tế bào gốc trưởng thành tự thân phù hợp về miễn dịch không gây những vấn đề đạo đức như sử dụng tế bào gốc phôi và đã được chứng minh là an toàn [32]. Hiện nay tế bào gốc trưởng thành có thể được lấy từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó mô mỡ được coi là một nguồn rất tiềm năng và dễ thực hiện để phân lập tế bào gốc dùng trong điều trị. Các nghiên cứu đầu tiên được triển khai tại Hàn Quốc và Úc tiêm trực tiếp tế bào gốc tự thân từ mô mỡ vào khớp để điều trị thoái hóa khớp gối và khớp háng cho thấy biện pháp điều trị này an toàn và bước đầu có hiệu quả tốt cho người bệnh [88], [120]. Huyết tương giàu tiểu cầu cũng đã được sử dụng tương đối rộng rãi trong điều trị thoái hóa khớp nhờ tác dụng của các yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu. Bên cạnh đó hoạt hóa quang bằng ánh sáng đơn sắc năng lượng thấp cũng có tác dụng kích thích các quá trình tăng sinh và biệt hóa của tế bào gốc.

Ở Việt Nam, ứng dụng tế bào gốc mô mỡ tự thân điều trị thoái hóa khớp gối tuy đã bắt đầu được quan tâm nghiên cứu nhưng mới chỉ dừng ở giai đoạn thử nghiệm ban đầu, chưa có các nghiên cứu hệ thống về số lượng và chất lượng của tế bào gốc mô mỡ ở bệnh nhân thoái hóa khớp gối sau phân lập, bảo quản, hoạt hóa bằng huyết tương giàu tiểu cầu tự thân và ánh sáng đơn sắc (nuôi cấy phân lập chọn lọc và tăng sinh tế bào gốc mô mỡ, phân tích dấu ấn bề mặt tế bào, khả năng bám dính của tế bào gốc mô mỡ được hoạt hóa và không hoạt hóa, khả năng tạo CFU-F trên in vitro…) cũng như đánh giá hiệu quả điều trị và tính an toàn của phương pháp. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phân lập, bảo quản, hoạt hóa và đánh giá hiệu quả điều trị của tế bào gốc mô mỡ tự thân đối với bệnh nhân thoái hoá khớp gối” nhằm hai mục tiêu:

1. Xác định một số đặc điểm của tế bào gốc mô mỡ ở bệnh nhân thoái hóa khớp gối sau phân lập, bảo quản và hoạt hóa bằng huyết tương giàu tiểu cầu tự thân và ánh sáng đơn sắc.

2. Đánh giá hiệu quả điều trị bệnh nhân thoái hoá khớp gối bằng tế bào gốc mô mỡ tự thân.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ

ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nghiên cứu phân lập, bảo quản, hoạt hóa và đánh giá hiệu quả điều trị của tế bào gốc mô mỡ tự thân đối với bệnh nhân thoái hoá khớp gối

1. Tạ Việt Hưng, Nguyễn Thị Phi Nga, Nguyễn Lĩnh Toàn, Trần Viết Tiến (2016), “Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân thoái hóa khớp gối điều trị bằng tế bào gốc mô mỡ tự thân tại Bệnh viện Quân y 103”, Tạp chí Y dược học Quân sự, 41(5), tr. 106 – 112.

2. Đỗ Minh Trung, Tạ Việt Hưng, Phạm Văn Trân, Lê Văn Đông, Đoàn Văn Đệ, Nguyễn Thị Phi Nga, Trần Viết Tiến (2015), “Đặc điểm phân lập, nuôi cấy, hoạt hóa tế bào gốc mô mỡ của bệnh nhân điều trị thoái hóa khớp gối tại Bệnh viện Quân y 103 – Học viện Quân y”, Tạp chí Y học Việt Nam, 429, tr. 294 – 300.

3. Tạ Việt Hưng, Trần Ngọc Dũng, Đỗ Minh Trung, Lê Văn Đông, Nguyễn Thị Phi Nga, Nguyễn Lĩnh Toàn, Trần Viết Tiến (2016), “Đánh giá mô bệnh học sụn khớp gối của bệnh nhân điều trị thoái hóa khớp bằng tế bào gốc mô mỡ tự thân ”, Tạp chí Y học Việt Nam, 445, tr. 10 – 15.

4. Tạ Việt Hưng, Nguyễn Thị Phi Nga, Trần Viết Tiến (2017), “Đánh giá kết quả lâm sàng và tính an toàn của phương pháp sử dụng tế bào gốc mô mỡ tự thân trong điều trị bệnh thoái hóa khớp gối”, Tạp chí Y học Việt Nam, 453, tr. 172 – 179.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Trần Ngọc Ân, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Nguyễn Mai Hồng (2013), “Thoái hóa khớp gối”, Phác đồ chẩn đoán và điều trị các bệnh cơ xương khớp thường gặp, tr. 178-184.

2. Nguyễn Thanh Bình (2012), Nghiên cứu đặc tính và hiệu quả của khối tế bào gốc tự thân từ tủy xương trong điều trị một số tổn thương xương khớp, Luận án tiến sĩ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội.

3. Bùi Hải Bình (2016), Nghiên cứu điều trị bệnh thoái hóa khớp gối nguyên phát bằng liệu pháp huyết tương giàu tiểu cầu tự thân, Luận án tiến sĩ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội.

4. Nguyễn Ngọc Châu (2012), Nghiên cứu mật độ khoáng xương, IL-1ft, TNF-a ở bệnh nhân thoái hóa khớp, Luận án tiến sĩ Y học, Học viện Quân Y, Hà Nội.

5. Đoàn Văn Đệ (2008), “Thoái hoá khớp”, Bệnh học nội khoa, tập 2, Nhà xuất bản Quân đội nhân dân, tr. 53-59.

6. Nguyễn Thị Thu Hà (2004), “Tế bào gốc và ứng dụng trong y sinh học”, TCNCYDHphụ bản 32 (6): tr. 13-26.

7. Đặng Hồng Hoa (1997), Nhận xét một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh hư khớp gối, Luận văn thạc sỹ y học, Trường Đại học Y Hà Nội.

8. Nguyễn Mai Hồng (2011), Nghiên cứu giá trị của nội soi trong chẩn đoán và điều trị thoái hoá khớp gối, Luận án tiến sỹ y học, Học viện Quân y, Hà Nội.

9. Nguyễn Mạnh Khánh (2011), Nghiên cứu ứng dụng ghép tế bào gốc tủy xương tự thân điều trị chậm liền xương, khớp giả thân xương chày, Luận án tiến sĩ Y học, Học viện Quân y, Hà Nội.

10. Mai Trọng Khoa và CS (2014), “Đánh giá kết quả phục hồi sụn khớp và cải thiện triệu trứng trên 48 khớp gối thoái hóa nguyên phát điều trị bằng liệu pháp tế bào gốc mô mỡ tự thân sau 6 tháng”, Tạp chí Y học Việt Nam, 429, tr. 218-224.

11. Nguyễn Thị Ngọc Lan (2012), “Thoái hóa khớp”, Bệnh học cơ xương khớp nội khoa, NXB Giáo dục, tr. 138-151.

12. Lê Thị Liễu và Nguyễn Mai Hồng (2009) “Nhận xét bước đầu về các hình ảnh siêu âm trong bệnh thoái hóa khớp gối”, Nội khoa, Hội Nội khoa Việt Nam, 4, tr. 96-101.

13. Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trương Định (2009), Công nghệ tế bào gốc, NXB Giáo dục.

14. Dương Đình Toàn, Đào Xuân Tích, Nguyễn Xuân Thùy và CS (2014), “Nghiên cứu hiệu quả sử dụng tế bào gốc tủy xương tự thân kết hợp nội soi tạo tổn thương dưới sụn điều trị thoái hóa khớp gối”, Tạp chí Y học Việt Nam, 429, tr. 207-217.

TIẾNG ANH

15. Amit M., Melissa K., Carpenter. et al. (2000), “Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture”, Developmental Biology, 227, p. 271¬278.

 

16. Anitua E., Sánchez M., Nurden A.T. et al. (2007), “Platelet-released growth factors enhance the secretion of hyaluronic acid and induce

 MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục

Danh mục chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các biểu đồ Danh mục các hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1. Những hiểu biết cơ bản về tế bào gôc 3

1.1.1. Khái niệm chung và phân loại 3

1.1.2. Cách gọi tên tế bào gốc 6

1.2. Tế bào gốc mô mỡ 8

1.2.1. Cấu trúc, chức năng và thành phần của mô mỡ 8

1.2.2.  Khái niệm chung về tế bào gốc mô mỡ 9

1.2.3.  Các đặc tính của tế bào gốc mô mỡ 11

1.3. Bệnh thoái hóa khớp 16

1.3.1. Định nghĩa và dịch tễ học bệnh thoái hóa khớp 16

1.3.2. Cơ chế bệnh sinh và vai trò các chất trung gian dị hóa – gây 18 đau trong thoái hóa khớp

1.3.3. Các phương pháp điều trị thoái hóa khớp 26

1.4. Tình hình nghiên cứu sử dụng tế bào gốc mô mỡ tự thân trong 34 điều trị thoái hóa khớp gối

1.4.1. Trên thế giới 35

1.4.2. Tại Việt nam 36

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1. Đối tượng nghiên cứu 38

2.2. Phương pháp nghiên cứu 39

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu 39

2.2.2. Các chỉ tiêu nghiên cứu 40

2.2.3. Phương tiện nghiên cứu 44

2.2.4. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 46

2.2.5. Thu thập và xử lý số liệu 59

2.2.6. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 59

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 60

3.1. Đặc điểm của các đối tượng nghiên cứu 60

3.1.1. Đặc điểm dịch tễ 60

3.1.2. Đặc điểm lâm sàng 62

3.1.3. Đặc điểm cận lâm sàng 63

3.2. Kết quả phân lập, bảo quản và hoạt hóa tế bào gốc mô mỡ 66

3.2.1. Kết quả chọc hút mô mỡ và phân lập SVF 66

3.2.2. Chất lượng tế bào gốc mô mỡ sau phân lập và bảo quản 67

3.2.3. Kết quả hoạt hóa TBG mô mỡ bằng HTGTC và ánh sáng đơn 72 sắc lên một số hoạt động của TBG trên in vitro

3.3. Kết quả điều trị của TBG mô mỡ tự thân đối với bệnh nhân 74 thoái hóa khớp gối

3.3.1. Kết quả lâm sàng 74

3.3.2. Kết quả cận lâm sàng 77

3.3.3. Tính an toàn của phương pháp điều trị thoái hóa khớp bằng 87 TBG mô mỡ tự thân hoạt hóa bởi HTGTC tự thân và ánh sáng đơn sắc

Chương 4: BÀN LUẬN 91

4.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 91

4.1.1. Đặc điểm về dịch tễ học 91

4.1.2. Đặc điểm lâm sàng 94

4.1.3. Đặc điểm cận lâm sàng 95

4.2. Hiệu quả của các quy trình phân lập, bảo quản và hoạt hóa tế 97 bào gốc mô mỡ

4.2.1. Quy trình chọc hút mô mỡ và phân lập SVF 97

4.2.2. Chất lượng tế bào gốc mô mỡ sau phân lập và bảo quản 98

4.2.3. Hoạt hóa TBG mô mỡ bằng HTGTC và ánh sáng đơn sắc 103

4.3. Đánh giá hiệu quả điều trị của TBG mô mỡ tự thân đối với 106 bệnh nhân thoái hóa khớp gối

4.3.1.  Đánh giá hiệu quả lâm sàng 108

4.3.2. Đánh giá hiệu quả cận lâm sàng 112

4.3.3. Đánh giá tính an toàn của phương pháp điều trị thoái hóa 118 khớp bằng TBG mô mỡ tự thân hoạt hóa bởi HTGTC tự thân và ánh sáng đơn sắc

KẾT LUẬN 121

KIẾN NGHỊ 123

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACD Acid citric Citrat natri Dextrose

ACR American Collegue of Rheumatology (Hội thấp khớp học Mỹ)

ADAMTS A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs

ADSC Adipose derived stem cells (tế bào gốc mô mỡ)

BMI Body Mass Index (chỉ số khối cơ thể)

CFU Colony Forming Unit (đơn vị tạo cụm)

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMSO Dimethyl sulfoxide

FBS Fetal Bovine Serum

HTGTC Huyết tương giàu tiểu cầu

IGF Insulin like Growth Factor (yếu tố tăng trưởng giống Insulin)

IL Interleukin

MMP Matrix Metalloproteinase

MSC Mesenchymal stem cell (tế bào gốc trung mô)

mPGES-1 microsomal Prostaglandin E Synthase-1

 

 

NSAIDs Non-steroidal anti-inflammatory drugs (thuốc chống viêm không steroid)

PRP Platelet Rich Plasma (huyết tương giàu tiểu cầu)

SVF Stromal vascular fraction (phân đoạn tế bào nền mạch máu)

TBG Tế bào gốc

TGF Transforming Growth Factor (yếu tố tăng trưởng chuyển dạng)

THK Thoái hóa khớp

TIMP Tissue Inhibitor Metalloproteinase

TNF Tumor Necrosis Factor (yếu tố hoại tử khối u)

VAS Visual Analog Scale (thang hiển thị loại suy đo mức độ đau)

WOMAC The Western Ontario and McMaster Universities Osteoarthritis Index (thang điểm đo mức độ cải thiện chức năng vận động của khớp)

 

 

 

Bảng Tên bảng Trang

1.1. Các dấu ấn trên bề mặt của TBG mô mỡ 12

3.1. Đặc điểm về tuổi, giới của các đối tượng nghiên cứu 60

3.2. So sánh chỉ số khối cơ thể của các đối tượng nghiên cứu 61

3.3. Thời gian phát hiện bệnh và giai đoạn bệnh 61

3.4. So sánh thang điểm VAS và thang điểm WOMAC 62

3.5. So sánh mức độ đau theo thang điểm VAS giữa hai nhóm 63

3.6. So sánh mức độ rối loạn chức năng vận động theo thang 63

điểm WOMAC giữa hai nhóm

3.7. So sánh các chỉ số hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và tốc độ 64

máu lắng giữa hai nhóm

3.8. So sánh các chỉ số sinh hóa giữa hai nhóm 64

3.9. Giai đoạn tổn thương khớp trên hình ảnh Xquang của hai 64

nhóm

3.10. Các chỉ tiêu đánh giá sụn khớp trên MRI của hai nhóm 65

3.11. Kết quả phân lập SVF từ mô mỡ (n = 42) 66

3.12. Tỷ lệ tế bào sống của SVF sau phân lập và bảo quản (n = 42) 67

3.13. Mức độ biểu hiện dấu ấn bề mặt CD90, CD105, CD13, 70

CD34, CD45, HLA-DR trên tế bào nuôi cấy sau cấy chuyển lần 3 (P3) (n=6)

3.14. Khả năng bám dính của TBG mô mỡ hoạt hóa và không hoạt 72 

hóa bằng HTGTC và ánh sáng đơn sắc (n = 42)

3.15. Khả năng tạo CFU-F của TBG mô mỡ hoạt hóa và không 73 hoạt hóa bằng HTGTC và ánh sáng đơn sắc (n = 6)

3.16. Số lượng tế bào trung bình mỗi lần tiêm 74

3.17. Điểm đau theo thang điểm VAS tại các thời điểm theo dõi 74

3.18. Biến đổi mức độ đau theo thang điểm VAS theo thời gian 75

theo dõi của nhóm nghiên cứu (n = 84)

3.19. Đặc điểm rối loạn chức năng vận động theo thang điểm 76 WOMAC theo thời gian theo dõi

3.20. Biến đổi mức độ rối loạn chức năng vận động theo thang 77 điểm WOMAC theo thời gian theo dõi của nhóm nghiên cứu

3.21. Số lượng bạch cầu theo thời gian theo dõi 78

3.22. Tốc độ máu lắng theo thời gian theo dõi 78

3.23. Đặc điểm tràn dịch khớp trên siêu âm theo thời gian theo dõi 78

3.24. Giai đoạn tổn thương khớp trên Xquang theo thời gian theo 79

dõi

3.25. Thay đổi độ dầy sụn trung tâm tại lồi cầu trong xương đùi 79 trên MRI theo thời gian theo dõi

3.26. Thay đổi độ dầy sụn trung tâm tại lồi cầu ngoài xương đùi 80 trên MRI theo thời gian theo dõi

3.27. Thay đổi độ dầy sụn trung tâm tại mâm chày trong trên MRI 81 theo thời gian theo dõi

3.28. Thay đổi độ dầy sụn trung tâm tại mâm chày ngoài trên MRI 81 theo thời gian theo dõi 

3.29. Thay đổi chỉ số Circularity tại lồi cầu trong xương đùi trên 81 MRI theo thời gian theo dõi

3.30. Thay đổi chỉ số Circularity của sụn tại lồi cầu ngoài xương 82 đùi trên MRI theo thời gian theo dõi

3.31. Thay đổi chỉ số Circularity của sụn tại mâm chày trong trên 83 MRI theo thời gian theo dõi

3.32. Thay đổi chỉ số Circularity của sụn tại mâm chày ngoài trên 83 MRI theo thời gian theo dõi

3.33. Mức độ tổn thương đại thể sụn khớp trước và sau điều trị 85

3.34. Mức độ tổn thương vi thể sụn khớp trước và sau điều trị 85

3.35. Sự phục hồi tổn thương sụn khớp BN BV103-37 86

3.36. Biến đổi chỉ hồng cầu và tiểu cầu ở hai nhóm 88

3.37. Biến đổi chỉ số sinh hóa ở hai nhóm 88 

 

 

“2 > 7 >

Biêu đô Tên biêu đô Trang

3.1. Tỷ lệ các nhóm nghề nghiệp ở các đối tượng nghiên cứu 62

3.2. Tỷ lệ tế bào sống của SVF trước và sau khi bảo quản 67

3.3. Biến đổi điểm đau theo thang điểm VAS theo thời gian 75

theo dõi

3.4. Biến đổi mức độ đau theo thang điểm VAS của nhóm 76 nghiên cứu

3.5. Biến đổi chỉ số Circularity ở nhóm nghiên cứu 84

Hình Tên hình Trang

1.1. Khả năng biệt hóa của TBG mô mỡ 14

1.2. Cơ chế bệnh sinh trong bệnh THK gối (Howell 1988) 19

1.3. Sinh bệnh học phân tử của thoái hóa khớp 2 0

1.4. Tín hiệu FGF-2 trong tế bào sụn khớp 24

1.5. PKCỖ là nút tín hiệu của nhiều con đường gây THK 2 5

2.1. Sơ đồ nghiên cứu 40

2.2. Thước đánh giá thang điểm đau VAS: mặt bệnh nhân quan 43

sát

2.3. Thước đánh giá thang điểm đau VAS: mặt số thầy thuốc 43

đánh giá

2.4. Tiêm dung dịch Tumescent 47

2.5. Kim hút mỡ và mô hình chọc hút mỡ 47

2.6. Rạch da và đưa kim hút mỡ thành bụng 47

2.7. Hút mỡ và bơm vào túi tách tế bào 48

2.8. Xử lý sạch mẫu mô mỡ bằng Nacl 0,9% 48

2.9. Xử lý mô mỡ với Cell Extraction Medium 49

2.10. Thu thập hỗn dịch chứa SVF 49

2.11. Ly tâm tách SVF 49

2.12. Ly tâm, chuyển lớp huyết tương và buffy coat 50

2.13. Hoạt hóa HTGTC bằng Calcium Activator Solution 50 

Hoạt hóa TBG mô mỡ và HTGTC tự thân bằng máy chiếu AdiLight 2

Máy Cytomics FC500 (Beckman Coulter – Hoa Kỳ)

Phân tích tổn thương sụn khớp trên MRI bằng phần mềm Image-J

Kỹ thuật tiêm TBG mô mỡ và HTGTC vào khớp gối

Các sản phẩm của quá trình phân lập TBG mô mỡ

Nuôi cấy tăng sinh TBG từ mô mỡ

Hình ảnh TBG mô mỡ nhuộm Giemsa

Kết quả phân tích biểu hiện một số dấu ấn bề mặt của TBG mô mỡ sau khi cấy chuyển lần 3 (P3)

Khả năng tạo CFU-F của TBG mô mỡ

Khả năng tạo CFU-F của 6 mẫu TBG mô mỡ hoạt hóa và không hoạt hóa bằng HTGTC và ánh sáng đơn sắc

Mô bệnh học sụn khớp BN BV103-37

Mô bệnh học màng hoạt dịch BN BV103-37 

ĐẶT VẤN ĐỀ