TỔNG HỢP VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN CAS9 TÁI TỔ HỢP TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI

TỔNG HỢP VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN CAS9 TÁI TỔ HỢP TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI
Hoàng Xuân Cường1, Đỗ Như Bình2
TÓM TẮT
Mục tiêu: Tổng hợp nhân tạo gen mã hóa Cas9 bằng công nghệ Golden gate và biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E. coli. Đối tượng và phương pháp: Nghiên cứu thực nghiệm, gen mã hóa protein Cas9 được tổng hợp bằng phương pháp Golden gate, biến nạp vào vector pET52b và biểu hiện ở tế bào E. coli. Tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực Ni-NTA.

Kết quả: Tạo thành công dòng tế bào E. coli BL21(DE3) mang vector pET52b-Cas9 có khả năng biểu hiện protein Cas9 tái tổ hợp ở pha tan. Thu nhận được protein Cas9 tái tổ hợp với nồng độ 4,1 mg/ml và độ tinh sạch kiểm tra bằng SDS-PAGE đạt ≥ 98%. Kết luận: Đã tạo được nguồn cung cấp protein Cas9 tái tổ hợp phục vụ cho các nghiên cứu trong lĩnh vực chỉnh sửa gen.

Trong suốt thập kỷ qua, các kỹ thuật thao tác DNA bộ gen dựa trên hoạt động của enzyme endonuclease được sử dụng rộng rãi như Zinc Finger Nucleases (ZFNs) và Transcription Activator Like Effector Nuclease (TALEN) [1]. Tuy nhiên, các phương pháp này có quy trình thiết kế và việc sử dụng trong thực tế rất phức tạp, do đó tính ứng dụng không cao, đặc biệt trong lâm sàng. Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã sử dụng thành công kỹ thuật biến đổi DNA bộ gen dựa trên hệ thống CRISPR/Cas [2, 3, 4]. Hệ thống này dựa trên cơ chế “miễn dịch” của vi khuẩn chống lại sự xâm nhiễm phân tử DNA ngoại lai từ virus hoặc DNA plasmid [6, 7]. Khác với hệ thống “miễn dịch” dựa trên enzyme cắt giới hạn, hệ thống này dựa trên phân tử RNA để nhận diện vàphá hủy DNA ngoại lai. Để bảo vệ vi khuẩn khỏi DNA ngoại lai, vi khuẩn cần được gắn chèn một đoạn ngắn DNA ngoại lai vào DNA bộ gen tại vùng trình tự lặp lại (CRISPR – Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)[5]. Vùng trình tự này được phiên mã và xử lý thành các đoạn RNA ngắn (gọi là crRNA-CRISPR-derived RNA), các crRNA này liên kết với endonuclease Cas để nhận diện DNA mục tiêu và cắt phân tử DNA mục tiêu thông qua hoạt động endonuclease của protein Cas