NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU HÒA LIPID MÁU CỦA CHẾ PHẨM TỪ BỘT SẤY PHUN ĐÀI HOA CỦA CÂY BỤP GIẤM

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU HÒA LIPID MÁU CỦA CHẾ PHẨM TỪ BỘT SẤY PHUN ĐÀI HOA CỦA CÂY BỤP GIẤM.Các bệnh lý do oxy hóa đang có xu hướng gia tăng trong xã hội phát triển. Trong số đó, rối loạn chuyển hóa lipid máu, nguyên nhân của các bệnh xơ vữa động mạch, bệnh mạch vành, viêm tụy, gan nhiễm mỡ, … có tỷ lệ ngày càng cao [43], [90]. Hiện nay, việc điều trị rối loạn lipid máu chủ yếu sử dụng những nhóm thuốc hóa dược như statin, fibrat, ezetimib hay thuốc ức chế PCSK9. Tuy nhiên, những nhóm thuốc này có nhược điểm là có thể gây ra tổn thương gan, viêm gan, viêm cơ hoặc những tác dụng có hại trên đường tiêu hóa; rất ít các thuốc điều trị rối loạn lipid sử dụng được trên bệnh nhân bị tổn thương chức năng gan [28], [79]. Vì vậy, việc tìm kiếm các liệu pháp, thuốc mới có hiệu quả và an toàn trong điều trị rối loạn chuyển hóa lipid, đồng thời có tác dụng bảo vệ gan đang là một vấn đề cấp thiết.

Trong nguồn nguyên liệu từ thiên nhiên vô cùng phong phú của thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, có rất nhiều cây thuốc, vị thuốc có khả năng làm giảm lipid máu đã được chứng minh qua các nghiên cứu và thực tế sử dụng [6]. Đặc biệt, trong số đó có Bụp giấm (Hibiscus sabdarifa L., Malvaceae), một loài cây nhiệt đới có khả năng thích nghi với nhiều loại đất khác nhau và đã được trồng thành công ở Bình Thuận, Việt Nam với quy mô rộng và đạt tiêu chuẩn VietGAP (Thực hành sản xuất nông nghiệp tốt). Bụp giấm chứa anthocyanin có tác dụng chống oxy hóa rất tốt, ngoài ra còn có alkaloid, chất đường, chất khoáng, acid hữu cơ,… Bộ phận thường sử dụng nhất là đài hoa do có chứa anthocyanin với hàm lượng có thể lên tới 1,5 g/kg đài hoa khô, với delphinidin và cyanidin là hai anthocyanin chính chiếm khoảng 71% và 29% [34]. Cho đến nay, trên thế giới đã có khá nhiều công trình nghiên cứu liên quan đến Bụp giấm như: Tác dụng giảm lipid máu của các polyphenol thông qua sự ức chế quá trình tạo mỡ và thúc đẩy sự thanh thải lipid ở gan, giảm độc tính của acetaminophen trên gan, hạ huyết áp, … [45], [62], [101]. Bên cạnh đó, theo các nghiên cứu tiền đề, bột sấy phun từ đài hoa2
Bụp giấm có tác dụng trên chuột nhắt gây rối loạn lipid máu nội sinh và ngoại sinh, có tác dụng bảo vệ gan trên mô hình chuột nhắt gây tổn thương tế bào gan bằng ethanol hoặc acetaminophen. Tuy nhiên, tác dụng này không tỷ lệ thuận với liều sử dụng, do đó, cần phải có những nghiên cứu nhằm xác định liều cũng như đánh giá độc tính của đài hoa Bụp giấm khi sử dụng thời gian dài nhằm đưa ra những khuyến cáo (nếu có) khi sử dụng trên lâm sàng [9], [10], [11]. Ngoài ra, bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm có nhược điểm là khá bất tiện khi sử dụng vì có vị chua, dễ hút ẩm, khó bảo quản. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng đề ra mục tiêu nghiên cứu bào chế một dạng chế phẩm thuận tiện để sử dụng xuất phát từ nguồn nguyên liệu bột sấy phun đài hoa của cây Bụp giấm. Việc nghiên cứu phát triển một chế phẩm từ bột sấy phun đài hoa của cây Bụp giấm mang đến triển vọng cao trong điều trị bệnh lý rối loạn lipid máu và các bệnh lý liên quan mà không làm tổn thương chức năng gan.
MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Mục tiêu chung: Nghiên cứu tác dụng điều hòa lipid máu của chế phẩm từ đài hoa của cây Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L., Malvaceae).
Mục tiêu cụ thể:
1. Xác định liều có tác dụng điều hòa lipid máu của bột sấy phun từ đài hoa của cây Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L., Malvaceae).
2. Xây dựng quy trình bào chế và tiêu chuẩn cơ sở, đánh giá độ ổn định của cốm Bụp giấm.
3. Khảo sát tác dụng của cốm Bụp giấm trên một số gen điều hòa chuyển hóa lipid: LDLR, SREBP-2, HMGCoA Reductase, AMPK.
4. Đánh giá tác dụng điều hòa rối loạn lipid máu và tác dụng dự phòng gan nhiễm mỡ của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng.
5. Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng

MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH – VIỆT …………….. i
DANH MỤC CÁC BẢNG …………………………………………………………………. iii
DANH MỤC CÁC HÌNH…………………………………………………………………… vi
MỞ ĐẦU ……………………………………………………………………………………………1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ………………………………………………………………….3
1.1. Rối loạn lipid máu ……………………………………………………………….3
1.2. Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L., Malvaceae)………………………36
1.3. Phương pháp nghiên cứu tác dụng của thuốc lên chuyển hóa lipid…44
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ………………………………..51
2.1. Đối tượng nghiên cứu …………………………………………………………51
2.3. Phương pháp nghiên cứu …………………………………………………….53
2.4. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu …………………………………….70
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ……………………………………………………………………71
3.1. Xác định liều có tác dụng điều hòa lipid máu của bột sấy phun từ
đài hoa của cây Bụp giấm……………………………………………………………………71
3.2. Xác định quy trình bào chế, tiêu chuẩn cơ sở và độ ổn định của
cốm Bụp giấm từ Bột sấy phun đài hoa Bụp giấm…………………………………74
3.3. Tác dụng của cốm Bụp giấm trên một số gen điều hòa chuyển hóa
lipid ………………………………………………………………………………………………….90
3.4. Tác dụng điều hòa lipid máu và tác dụng dự phòng gan nhiễm mỡ
của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng …………………………………………………96
3.5. Độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của cốm Bụp giấm trên
chuột nhắt………………………………………………………………………………………..106
CHƯƠNG IV. BÀN LUẬN ………………………………………………………………114
4.1. Liều có tác dụng của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm………..114
4.2. Cốm Bụp giấm…………………………………………………………………116
4.3. Tác dụng của cốm Bụp giấm trên một số gen điều hòa chuyển hóa
lipid ………………………………………………………………………………………………..1214.4. Tác dụng điều hòa rối loạn lipid máu và dự phòng gan nhiễm mỡ
không do rượu của cốm Bụp giấm………………………………………………………127
4.5. Độc tính của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt ………………………..132
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……………………………………………………………135
Kết luận…………………………………………………………………………………135
Kiến nghị……………………………………………………………………………….137
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm của các thuốc statin ……………………………………………….20
Bảng 1.2. Phân loại các thuốc statin ……………………………………………………..20
Bảng 1.3. Một số dược liệu được sử dụng dự phòng và điều trị rối loạn lipid
máu…………………………………………………………………………………………………..29
Bảng 1.4. Một số bài thuốc (công thức phối hợp) được sử dụng dự phòng và
điều trị rối loạn lipid máu ……………………………………………………………………31
Bảng 1.5. Một số nghiên cứu đánh giá tác động của thuốc lên quá trình chuyển
hóa lipid mức độ phân tử và tế bào……………………………………………………….45
Bảng 1.6. Một số mô hình gây tăng lipid máu bằng chế độ ăn …………………47
Bảng 1.7. Một số mô hình gây tăng lipid máu bằng tyloxapol (triton WR-1339)….48
Bảng 2.1. Các công thức bào chế được khảo sát …………………………………….56
Bảng 2.2. Các chỉ tiêu thử nghiệm trong theo dõi độ ổn định…………………..61
Bảng 2.3. Theo dõi độ ổn định ở điều kiện lão hóa cấp tốc ……………………..61
Bảng 2.4. Theo dõi độ ổn định ở điều kiện thường …………………………………61
Bảng 2.5. Trình tự các nucleotid của các mồi (primer) ……………………………63
Bảng 3.1. Nồng độ lipid máu của các lô thử nghiệm tại thời điểm ban đầu……..71
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát các công thức phối hợp bào chế cốm Bụp giấm ……75
Bảng 3.3. Độ ẩm của cốm Bụp giấm …………………………………………………….77
Bảng 3.4. Độ đồng đều khối lượng của cốm Bụp giấm……………………………77
Bảng 3.5. Độ tan của chế phẩm cốm Bụp giấm………………………………………78
Bảng 3.6. Phản ứng thay đổi màu trong các môi trường của anthocyanin….79
Bảng 3.7. Hàm lượng hoạt chất trong 3 lô cốm Bụp giấm ……………………….82
Bảng 3.8. Các thông số sắc ký ứng với đỉnh delphinidin-3-O-sambubiosid
trong 6 lần tiêm mẫu liên tiếp ………………………………………………………………82
Bảng 3.9. Các thông số sắc ký ứng với đỉnh cyanidin-3-O-sambubiosid trong
6 lần tiêm mẫu liên tiếp……………………………………………………………………….83iv
Bảng 3.10. Kết quả diện tích đỉnh theo nồng độ delphinidin-3-O-sambubiosid
và cyanidin-3-O-sambubiosid ………………………………………………………………84
Bảng 3.11. Kết quả đánh giá độ lặp lại quy trình định lượng delphinidin-3-Osambubiosid và cyanidin-3-O-sambubiosid trong cốm Bụp giấm………………..85
Bảng 3.12. Kết quả độ đúng của quy trình định lượng delphinidin-3-Osambubiosid và cyanidin-3-O-sambubiosid trong cốm Bụp giấm ………………86
Bảng 3.13. Kết quả theo dõi độ ổn định của cốm Bụp giấm ở điều kiện lão hóa
cấp tốc ………………………………………………………………………………………………87
Bảng 3.14. Kết quả định lượng cốm Bụp giấm ở thời điểm ban đầu …………87
Bảng 3.15. Kết quả theo dõi độ ổn định của cốm Bụp giấm ở điều kiện bảo dài
hạn……………………………………………………………………………………………………88
Bảng 3.16. Kết quả định lượng cốm Bụp giấm ở thời điểm sau 6 tháng ……89
Bảng 3.17. Kết quả định lượng cốm Bụp giấm ở thời điểm sau 12 tháng…….89
Bảng 3.18. Phần trăm gây độc của các mẫu trên dòng tế bào ung thư gan Hep
G2 ở các nồng độ khác nhau được xác định bằng phương pháp SRB ………..90
Bảng 3.19. Sự thay đổi biểu hiện các gene của các mẫu ………………………….94
Bảng 3.20. Nồng độ lipid máu của các lô thử nghiệm tại thời điểm ban đầu …….96
Bảng 3.21. Nồng độ lipid máu của các lô trong thử nghiệm tại thời điểm ban
đầu……………………………………………………………………………………………………99
Bảng 3.22. Nồng độ lipid máu của các lô trong thử nghiệm sau 8 tuần gây
bệnh bằng dung dịch giàu lipid…………………………………………………………….99
Bảng 3.23. Nồng độ lipid máu của các lô trong thử nghiệm tại thời điểm ban
đầu………………………………………………………………………………………………….102
Bảng 3.24. Kết quả thử nghiệm độc tính cấp của cốm Bụp giấm ……………106
Bảng 3.25. Kết quả theo dõi cân nặng của các lô trong thử nghiệm độc tính
bán trường diễn ………………………………………………………………………………..107
Bảng 3.26. Chỉ số xét nghiệm sinh hóa sau 6 tuần của các lô chuột trong thử
nghiệm độc tính bán trường diễn ………………………………………………………..110v
Bảng 3.27. Chỉ số xét nghiệm sinh hóa sau 12 tuần của các lô chuột trong thử
nghiệm độc tính bán trường diễn ………………………………………………………..110
Bảng 3.28. Chỉ số xét nghiệm huyết học sau 6 tuần của các lô chuột trong thử
nghiệm độc tính bán trường diễn ………………………………………………………..111
Bảng 3.29. Chỉ số xét nghiệm huyết học sau 12 tuần của các lô chuột trong
thử nghiệm độc tính bán trường diễn…………………………………………………..

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Con đường chuyển hóa lipid……………………………………………………6
Hình 1.2. Sự điều hòa con đường mevanonate của SREBP-2…………………..12
Hình 1.3. Chuyển hóa lipid ở gan…………………………………………………………13
Hình 1.4. Cây Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L., Malvaceae) ……………………………..37
Hình 1. 5. Vị trí cây Bụp giấm trong bảng phân loại hệ thống thực vật……..37
Hình 2.1. Đài hoa Bụp giấm ………………………………………………………………..51
Hình 2.2. Hướng dẫn dự đoán tuổi thọ của thuốc theo ASEAN (2013)……..60
Hình 3.1. Nồng độ lipid máu của lô bệnh lý tại thời điểm ban đầu và sau 48
giờ tiêm tyloxapol………………………………………………………………………………72
Hình 3.2. Nồng độ lipid máu của các lô sau khi tiêm tyloxapol 48 giờ ……..73
Hình 3.4. Quy trình bào chế cốm Bụp giấm, lô nghiên cứu……………………..76
Hình 3.4. Cốm Bụp giấm …………………………………………………………………….77
Hình 3.5. Phản ứng thay đổi màu trong các môi trường của cốm Bụp giấm…..79
Hình 3.6. Sắc ký đồ của cốm BG và đài hoa Bụp giấm ở UV 365 nm và dưới
ánh sáng thường…………………………………………………………………………………81
Hình 3.7. Sắc ký đồ HPLC đánh giá tính đặc hiệu của quy trình định lượng
delphinidin-3-O-sambubiosid và cyanidin-3-O-sambubiosid…………………….83
Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện sự tương quan giữa nồng độ và cường độ hấp
thu …………………………………………………………………………………………… 84
Hình 3.9. Kết quả điên di khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi ở các nhiệt độ 54
oC, 57 oC, 60 oC và 63 oC bằng RT-PCR……………………………………………….91
Hình 3.10. Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi ở các nhiệt độ 54
oC, 57 oC, 60 oC và 63 oC bằng RT-PCR (HMGCoA và AMPK)……………..92
Hình 3.11. Kết quả khảo sát đường cong nóng chảy của các gen LDLR,
SREBP2, HMGCoA, AMPK……………………………………………………………….93
Hình 3.12. Số lần làm tăng, giảm biểu hiện gen của các mẫu thử nghiệm……..95vii
Hình 3.13. Nồng độ lipid máu của lô bệnh lý không được điều trị tại thời điểm
ban đầu và sau 48 giờ tiêm tyloxapol ……………………………………………………97
Hình 3.14. Nồng độ lipid máu so với ban đầu của các lô sau 48 giờ tiêm
tyloxapol …………………………………………………………………………………………..98
Hình 3.15. Nồng độ lipid máu của lô bệnh lý, không được điều trị (mg/dl)….100
Hình 3.16. Mức độ thay đổi nồng độ lipid máu của các lô trong thử nghiệm
sau 1 tuần điều trị so với thời điểm sau khi gây bệnh 8 tuần…………………..100
Hình 3.17. Nồng độ lipid máu của các lô trong thử nghiệm sau 6 tuần ……102
Hình 3.18. Chỉ số lipid máu của các lô chuột trong thử nghiệm sau 4 tuần ……103
Hình 3.19. Chỉ số sinh hóa máu của các lô chuột trong thử nghiệm sau 4
tuần………………………………………………………………………………………… 104
Hình 3.20. Trọng lượng các lô chuột trong 4 tuần thử nghiệm ……………….104
Hình 3.21. Hình ảnh vi thể gan bình thường và viêm gan mạn tính mức độ nhẹ
có kèm thoái hóa mỡ…………………………………………………………………………105
Hình 3.22. Lượng nước uống của các lô chuột trong thử nghiệm độc tính bán
trường diễn………………………………………………………………………………………109
Hình 3.23. Lượng thức ăn của các lô chuột trong thử nghiệm độc tính bán
trường diễn………………………………………………………………………………………109
Hình 3.24. Hình ảnh vi thể gan, thận của các lô trong thử nghiệm độc tính bán
trường diễn………………………………………………………………………………………112
Hình 3.25. Chỉ số trọng lượng gan, thận, lách của các lô chuột trong thử
nghiệm độc tính bán trường diễn………………………………………………………..11